Aspergilosis invasiva revisión de su diagnóstico actual

INTRODUCCIÓN

La aspergilosis invasora (IA) se presenta como la causa más común de infecciones oportunistas respiratorias y diseminadas en pacientes inmunocomprometidos por diversas causas como cánceres hematológicos, receptores de trasplante de precursores hematopoyéticos (TPH), trasplante de órganos sólidos (TOS), pacientes que reciben corticosteroides por períodos prolongados, pacientes con infección por VIH, el uso de fármacos inmunosupresores o agentes biológicos; causando índices de mortalidad que oscilan entre un 70 a 90 % (1-3).

Esta enfermedad fúngica puede afectar a cualquier órgano y causar infecciones a nivel cutáneo, ótico, oftálmico, causar alergias, y en un 30 % puede llegar a ser diseminada; el mecanismo más frecuente de adquisición de la enfermedad es por vía inhalatoria, donde el área pulmonar es la más afectada seguida por el área rinosinusal; por esta razón la aspergilosis pulmonar invasiva (API) es la más estudiada y valorada debido a su comportamiento clínico no muy específico, ya que puede confundirse con otras patologías infecciosas como la tuberculosis, scedosporiosis, entre otras (1,4-6).

La aspergilosis es una enfermedad cosmopolita, con amplia distribución a nivel mundial, producida por hongos del género Aspergillus. La mayoría de las aspergilosis invasivas son causadas por especies de la sección Fumigati, aproximadamente de un 75 a 80 % de las infecciones pulmonares y diseminadas, seguido de las secciones Nigri, Flavi, Terrei, Nidulantes, Versicolores y Usti y algunas especies de Aspergillus glaucus (1,3,7).

En la actualidad el diagnóstico clínico de la AI es un desafío, ya que se intenta hacer un juicio precoz, para disminuir el porcentaje de mortalidad. En la aspergilosis invasiva el diagnóstico es multifactorial donde se involucra la epidemiología, el laboratorio (microbiológico e histopatológico) y la clínica del paciente (6). Es por ello que los criterios diagnósticos formulados y actualizados por la Organización europea para la investigación y tratamiento del cáncer (EORTC por sus siglas en inglés) y el Consorcio de educación e investigación del grupo de estudio de micosis (MSG ERC por sus siglas en inglés), son ampliamente utilizados para el abordaje diagnóstico, estableciendo tres determinaciones de la aspergilosis: posible, probable y probada. Además, incluye la utilización de métodos moleculares en las diferentes definiciones de casos (8).

Este artículo de revisión se presenta como una puesta al día de AI en aspectos de etiología, patogenia, manifestaciones clínicas y sobre todo desde el punto de vista de diagnóstico.

Aspergillus spp., como agente etiológico

El género Aspergillus, forma parte del grupo de mohos o hongos filamentosos saprófitos (5), clasificados dentro de la familia Aspergillaceae, orden Eurotiales, sub-clase Eurotiomycetidae, clase Eurotiomycetes, sub-phylum Pezizomycotina, Phylum Ascomycota, sub-reino Dikarya y Reino Fungi (9), con una variedad aproximada de 900 especies, divididas en cinco subgéneros: Fumigati, Circumdati, Nidulantes y Polypaecilum (7), que a su vez se subdividen en varias secciones o complejos de especies, donde aproximadamente 40 de ellas pueden ser patógenas u oportunistas causando enfermedades en los seres humanos (3,5).

El género Aspergillus, está constituido por hifas hialinas septadas, pueden tener reproducción sexual (con formación de ascosporas en el interior de ascas) y asexual (con formación de conidios). Debido a que no presentan condiciones abióticas muy selectivas y poseen un efectivo mecanismo de dispersión de sus esporas, éstas se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza, como en tierra, material vegetal en descomposición, polvo, material de construcción, plantas, alimentos y agua. La mayoría de las especies de este género crecen en un amplio rango de temperatura (6°C - 55°C) y una humedad relativa baja. Estas especies pueden diferenciarse entre sí por:

1. Su morfología microscópica: como tamaño y forma de las cabezas conidiales, conformación de los conidióforos, fiálides y métulas y la presencia de células de Hülle y de esclerocios como mecanismo de supervivencia.
2. Por su morfología macroscópica: como tamaño y tasa de crecimiento del hongo en los diferentes medios utilizados, texturas diferentes como aterciopelada, granular, algodonosa, color de la colonia y coloración de las estructuras aéreas, tanto en el micelio como en las cabezas conidiales (7).

Patogenia de la aspergilosis pulmonar invasora

La etapa inicial da comienzo con la inhalación de conidias por el ser humano; normalmente se calcula que inhalamos más de 200 conidias diarias, sin producir ninguna enfermedad al ser eliminadas eficientemente por el sistema inmunitario. Sin embargo, en algunos huéspedes, las conidias tiene mayor facilidad para alcanzar el tracto respiratorio inferior y por su mínimo tamaño se depositan en los alvéolos (10). Dependiendo de la respuesta del hospedador, el hongo sobrevive bajo diferentes condiciones de estrés, desarrollando mecanismos adaptativos que le permiten resistir las condiciones desfavorables en los pulmones y contrarrestar los cambios ambientales de temperatura, pH, agua, balance y plasticidad en la adquisición de nutrientes, estrés oxidativo y moléculas, con ciertas propiedades antifúngicas, más la respuesta inmune del hospedador (3,11). Figura 1. En relación con lo antes expuesto pueden ocurrir un amplio espectro de enfermedades tales como manifestaciones alérgicas (aspergilosis broncopulmonar alérgica), más frecuentes en el hospedador inmunocompetente, la formación de bolas fúngicas (aspergilomas), que veremos en pacientes con cavidades pulmonares pre-existentes y la enfermedad invasora, característica del hospedador inmunosuprimido (10).

Reacción inmunológica de la aspergilosis pulmonar invasora

La pared celular fúngica es la principal fuente de epítopos o determinantes antígenicos que activan al sistema inmunitario, una vez que los conidios son inhalados, la barrera física de las vías respiratorias es la primeria línea de defensa contras los conidios inhalados, seguido del epitelio respiratorio el cual es invadido por el hongo (12). Se ha demostrado que el epitelio produce citocinas y péptidos antimicrobianos que ayudan a la eliminación del hongo, sin embargo, cuando está debilitado, bien sea por una enfermedad del tracto respiratorio u otra inmunosupresión, los conidios escapan del epitelio respiratorio e invaden los tejidos más profundos. Una vez ubicados en el tracto respiratorio inferior, los conidios se adhieren a la membrana basal pulmonar y son desafiados por las células del sistema inmunitario innato, que incluye los macrófagos alveolares residentes y células dendríticas

(13). Para que estos elementos de la inmunidad se puedan unir al hongo necesitan reconocer al patógeno. Esto es posible gracias a la acción de los receptores reconocedores de patrones (RRP). Los RRP más importantes en la respuesta del hospedador frente a la infección por Aspergillus son los TLR (Toll-like receptor de sus siglas en inglés) y la dectina-1 (14). Entre los TLR existen dos que presentan un papel imprescindible en la respuesta del huésped frente a la infección por Aspergillus, el TLR2 y el TLR4 (13,14).

En la membrana basal, los conidios comienzan a germinar, es allí cuando se inicia el reclutamiento de neutrófilos y monocitos. Elementos como las Trampas extracelulares de neutrófilos (TEN) contribuyen a la defensa innata del hospedador in vivo y los neutrófilos ejercen una variedad considerable de funciones efectoras antifúngicas, que incluyen el reconocimiento, la fagocitosis, la eliminación intracelular mediada por mecanismos oxidativos y no oxidativos, la secreción de moléculas antimicrobianas y la liberación de las TEN (14). Si estos mecanismos del sistema inmune innato no actúan, la germinación de los conidios se traduce en el crecimiento de hifas tabicadas y ramificadas, ocurre la invasión del tejido pulmonar y marca el inicio de la enfermedad fúngica. Las células inmunitarias innatas expresan un amplio repertorio de receptores y se activan funciones efectoras como la producción de citocinas proinflamatorias y quimiocinas, como el TNF-alpha, interleuquinas IL-1, IL8, IL12, IL-15, interferón-gamma, producidas por células epiteliales pulmonares A549 y por los macrófagos alveolares que se asocia a un efecto de protección frente la infección (3,11).

De esta respuesta citoquímica se generará una respuesta adaptativa mediada por los linfocitos Th1. Por el contrario, la activación del TLR2 favorece una respuesta citoquímica antinflamatoria, mediada por la IL-10 y la IL-4, y como consecuencia, promueve una respuesta del sistema inmune adaptativo mediado por los linfocitos Th2, relacionados con una mayor susceptibilidad a padecer infección fúngica invasora (13).

Estas lesiones que el hongo deja en el momento de la invasión del tejido pulmonar, se asemejan a cavernas, provocando un infarto hemorrágico o un absceso piógeno, ya que puede verse afectada una rama de la arteria pulmonar, lo cual causa fenómenos trombóticos y necrosis localizada (3,4). Este centro necrótico, puede contener restos celulares, fibras reticulares e hifas, y en los casos crónicos se ven numerosas hifas tabicadas, sin conidios. Esta variedad clínica se disemina con gran facilidad a diversos órganos, por la inmunosupresión del hospedador y por la invasividad del hongo, la cual es generada por una enzima hidrolítica similar a la tripsina (15).

Manifestaciones clínicas

Cuando la sintomatología es muy marcada, puede cursar con tos constante, expectoración mucopurulenta, hemoptisis, fiebre moderada persistente (38 °C por cinco a siete días), dolor pleural, disnea, astenia y adinamia. Conforme el proceso avanza, se genera trombosis de los vasos y necrosis localizada; si existe angio-invasión, las especies de Aspergillus se pueden diseminar más allá del tracto respiratorio y afectar piel, sistema nervioso central (SNC), ojos, hígado, riñones y otros órganos (16).

En pacientes con neutropenia marcada y prolongada, tratamientos extensos con esteroides, trasplante de médula ósea u otros órganos, pacientes con citomegalovirus, COVID-19 o SIDA avanzado, pueden justificar una ausencia de reacción inflamatoria y predominio de los fenómenos necróticos (17).

A nivel radiológico y por tomografía axial computarizada (TAC), se pueden observar infiltrados tipo nódulos rodeados de halos, que representan la hemorragia segundaria a la angio-invasión característica del hongo, cavitaciones o lesiones triangulares con base pleural. Si el cuadro de la API está muy avanzado, pueden observarse una necrosis en el interior de un infiltrado de leucocitos polimorfonucleares, donde se puede apreciar una bola micótica (1,2,6).

En otro contexto, si la órbita se ve afectada pueden asociarse síntomas oculares como visión borrosa, proptosis, equimosis, parálisis oculomotora o ceguera por trombosis de la arteria central de la retina. La infección puede extenderse por vía hematógena al seno cavernoso, produciendo trombosis de este con extensión y diseminación al SNC. La aspergilosis del SNC puede observarse como una enfermedad diseminada o extensión previa a una aspergilosis sinusal. La clínica neurológica puede conllevar deterioro cognitivo, déficit focal o crisis comiciales (3).

Diagnóstico

El diagnóstico de la API es complicado. La presencia de inmunosupresión severa favorece a una inexpresión clínica, retrasando el diagnóstico, condicionando a pronóstico precario y una mayor mortalidad (1,18). En la actualidad, los criterios de diagnóstico de la API se armonizan con los criterios diagnósticos del grupo EORTC/MSG, que involucran tanto factores del hospedador, como factores microbiológicos e histopatológicos y clínicos para concluir, si se trata de una infección posible, probable o probada (19).

Una infección posible comprende factores del hospedador como inmunosupresión, neutropenia marcada, administración de corticoesteroides por tiempo prolongado, uso de catéteres, entre otros; más criterios clínicos donde se observe la presencia de nódulos con o sin halos en imágenes por TAC, pero sin criterios micológicos (15).

Una infección probable corresponde los factores del hospedador junto con los criterios clínicos y criterio micológico, se sospecha en el caso de API, ya que el paciente puede presentar infiltrados pulmonares sospechosos, con ciertos análisis micológicos sugestivo de Aspergillus spp., pero sin una confirmación micológica definitiva, es decir, sin la demostración de la presencia del hongo en el cultivo (20).

Una infección probada refiere una tinción y/o cultivo que demuestre levaduras u hongos filamentosos en sangre o muestra clínica de cavidad estéril o estudio histológico con evidencia de invasión fúngica. La infección probada se diferencia de la probable, porque se demuestra la presencia del hongo (21).

Dentro de los criterios micológicos para el diagnóstico de la API encontramos dos categorías generales. Los directos: como los cultivos, microscopía del hongo e histopatología; y los indirectos: que serían las pruebas serológicas, biomarcadores (inmunoensayos enzimáticos), PCR, proteómica, entre otros (11).

Cultivo, microscopía e histopatología

El cultivo y la microscopía son esenciales para el diagnóstico de API, pero expresan una sensibilidad baja y limitada con tiempos prolongados de diagnóstico, por lo que un cultivo negativo no excluye el diagnóstico de la aspergilosis invasora (22).

Con respecto a las muestras para el diagnóstico de la API, se manejan diversos tipos como: esputo, cepillado broncoalveolar, lavado broncoalveolar, exudados bronquiales y endotraqueales y fragmentos de biopsia (3).

La siembra de las muestras se debe realizar en medios de uso primario micológico, como agar Sabouraud dextrosa (ASD) (10). No es recomendable utilizar medios con antibióticos, porque algunas especies de Aspergillus se inhiben con la cicloheximida usada en el medio Micosel. Estos hongos son contaminantes del ambiente, e incluso de vías respiratorias, piel y conducto auditivo externo, es importante hacer la confirmación del aislamiento del hongo con una nueva muestra cuando la misma no provenga de sitios estériles como el esputo (22).

Las colonias de la mayoría de las especies patógenas de Aspergillus en el humano, son de crecimiento rápido, con un periodo de incubación de uno a tres días, desarrollándose a temperaturas en el laboratorio: temperatura ambiental de 24 a 26 °C y de 35 a 37 °C, con morfologías macroscópicas características de cada especie. En el examen directo de la muestra con KOH y/o tinción de Giemsa se pueden apreciar hifas hialinas septadas, delgadas (3-6 micras) con ramificaciones dicotómicas en ángulos de 45 grados, rara vez se logran observar estructuras conidiales (22,23) Figura 2.

Para el examen directo de la colonia crecida del cultivo o microcultivo, se puede utilizar azul de Cotton como colorante, el cual permite diferenciar con mayor facilidad la morfología microscópica entre cada especie. Figura 2 (20). Es importante que, si se obtiene crecimiento del hongo, hacer la correcta diferenciación en especies o complejo de especies para poder orientar al clínico sobre el tratamiento más adecuado o correcto (24).

El estudio histológico es uno de los pilares básicos para la confirmación de una micosis invasora, bien sea ante mortem o post mortem, sin embargo, tiene muchas limitantes en cuanto a la experiencia del personal en la patología de las infecciones fúngicas y la observación de estructuras características, ya que estas son observables de manera abundante cuando la infección se encuentra en estadios avanzados, con daños orgánicos importantes yavecesirreversibles(6). Ellaboratoriodepatologíadebe realizar simultáneamente tinciones fúngicas estándar y especiales en líquidos o tejidos cuando se sospecha una infección fúngica, pudiendo revelar la presencia de hifas septadas ramificadas de ángulo agudo características de Aspergillus spp (7). Las tinciones especiales en tejido fijo incluyen tinción de plata metenamina o tinción de Grocott-Gomori (GMS), tinción con ácido periódico-Schiff (PAS) y hematoxilina-eosina (HE). Sin embargo, ningún hallazgo histopatológico puede diagnosticar definitivamente el patógeno y es necesaria la confirmación mediante cultivo o mediante otras técnicas para distinguir Aspergillus de otros hongos filamentosos (21,22,24).

β-D-glucano

El glucano es un polisacárido estructural muy importante de la pared fúngica y constituye más del 50% de su peso seco. La mayoría de los polímeros de glucano están compuestos de unidades de glucosa con uniones b-(1®3) (65-90%), y en menor proporción otros tales como el ß-(1®4), a-(1®3) y a-(1®4) (26).

El (1®3)-b-D-glucano (BDG) o b-(1®3) glucano es estructuralmente esencial y el más importante de la pared fúngica, al que se unen covalentemente otros componentes que forma parte de la gran variedad de hongos como Candida, Aspergillus, Fusarium, Pneumocystis, entre otros (3,26,27). Figura 3.

Este polisacárido se sintetiza por un complejo de enzimas sitiado en la membrana plasmática denominada glucano sintetasa que es codificado por los genes FKS1 y FKS2. Estas enzimas catalizan la formación de cadenas lineales de glucano unidos por enlaces b-(1®3) y que dan lugar a estructuras ramificadas unidas a otros glucanos, quitina o mananoproteínas. En la reorganización estructural dinámica de la pared fúngica, durante los cambios morfológicos como el crecimiento celular ramificado, la división celular y la germinación en hongos filamentosos, estos BDG se liberan, por lo que, en el momento de una infección activa, pueden ser detectados como un biomarcador (exoantígeno) y su valoración sérica determina una probable infección fúngica (3,26,28,29).

Las pruebas comerciales para la determinación de BDG en suero, son consideradas como un marcador panfúngico, que incluye la detección de Candida spp., Aspergillus spp., Fusarium spp., Trichosporon spp., Saccharomyces cerevisiae, Acremonium spp., Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Sporothrix schenckii, Exserohilum rostratum y Pneumocystis jirovecii, mas no en hongos del género Cryptococcus y Mucorales, ya que no producen o presentan concentraciones muy bajas de BGD (30,31).

La mayoría de los ensayos para la detección de BDG son pruebas colorimétricas que utilizan cromógenos como zimógenos de proteasas que pueden detectar cualitativamente al BDG. Como ejemplo de estas técnicas tenemos el ensayo Fungitell®, basado en una modificación de la ruta del lisado de amebocitos Limulus (LAL, herradura de cangrejo), que elimina la reactividad cruzada con endotoxinas bacterianas, para que se detecte únicamente el (1®3)-b-D-glucano por el lado de la ruta mediado por el factor G (que es un zimógeno de serina proteasa). El BDG activa al factor G, y este activado, convierte la enzima procoagulante inactiva en enzima coagulante activa, que, a su vez, divide la para-nitroanilida (pNA) del sustrato de péptido cromógeno, Boc-Leu-Gly-Arg-pNA, creando un cromóforo (paranitroanilina) que se absorbe a 405 nm. Procedimiento que se determina utilizando una muestra de suero y midiendo el aumento de la densidad óptica (31).

Entre otros kits o técnicas comerciales para la detección de BDG podemos encontrar ensayos cuantitativos como el b-Glucan test de Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation, que se basa en el mismo principio del Fungitell®. Recientemente se han comercializado kits que detectan BDG por inmunoensayos de quimioluminiscencia (VIRCLIA®) en muestras de suero y lavado broncoalveolar (LBA) (29).

Estas pruebas no resultan muy específicas para el diagnóstico de API, sobre todo cuando se trata de pacientes inmunocomprometidos con más de una infección fúngica, ya que se han observado muchos falsos positivos, al igual que falsos negativos en pacientes con tratamiento antimicrobiano, fabricados a partir de microorganismos fúngicos, como es el caso de la amoxicilina/ácido clavulánico (3,25).

Galactomanano

El galactomanano (GM) es un polisacárido de la pared fúngica, sin embargo, podemos obtener falsos positivos y reacciones cruzadas con otros hongos como especies de Fusarium, Penicillium, Histoplasma y Candida, que también poseen cadenas laterales de galactofuranosa (11,32). Cuando el hongo produce infección tisular, proliferación y diseminación, estas son liberadas. Su detección se considera la prueba más útil para el diagnóstico precoz de API y aspergilosis diseminada; asimismo, se puede utilizar como prueba de seguimiento terapéutico, observando una disminución de la lectura inicial con respecto a la lectura post tratamiento (8). Las pruebas utilizadas para la detección de GM de Aspergillus spp, se realizan por medio de técnicas como el ensayo inmunoenzimático, el ensayo de flujo lateral o inmunocromatográfico y por inmunoensayo quimioluminiscente (33, 47).

Citando como ejemplo del ensayo inmunoenzimático encontramos el kit de Platelia™ (Bio-Rad), una determinación tipo sándwich (ELISA) en microplacas de un solo paso que detecta antígenos de galactomanano. Este método utiliza anticuerpos monoclonales EBA-2 de rata, que se dirigen contra las cadenas laterales de 1-5 D-galactofuranósido del galactomanano de Aspergillus. Este ensayo está aprobado por la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos (FDA) únicamente a partir de muestras de suero y LBA (11,19,28,32,34).

Las muestras de suero o LBA se tratan con calor en presencia de EDTA para disociar los complejos inmunes y precipitar las proteínas que puedan interferir con la prueba, luego estas muestras previamente tratadas y junto con el conjugado, se añaden a los pocillos recubiertos con anticuerpos monoclonales y se incuban. Se formará un complejo anticuerpo monoclonal-galactomanano-anticuerpo monoclonal/peroxidasa en presencia del antígeno galactomanano que, agregando el sustrato, reaccionará con los complejos ligados al pocillo para dar una reacción de color azul. La adición de ácido detiene la reacción enzimática y cambia el color azul por amarillo. La densidad óptica se determina con un espectrofotómetro configurado con una longitud de onda de 450 y 620 nm (11,32).

La sensibilidad y especificidad de la prueba es del 75 % a 94 % (media del 83 y de 97 % a 99 % respectivamente con eficacia global entre 83 % y 96 %), siendo más sensible y con mejor rendimiento diagnóstico la detección en LBA que en suero. Es importante saber que las diferentes especies pueden liberar más de estos exoantígenos, y en orden decreciente encontramos: A. terreus, A. niger, A. flavus y A. fumigatus. La exposición a antifúngicos compromete la utilidad de la prueba para el diagnóstico del GM por lo que reduce su sensibilidad (11,18,19,32).

Entre los ensayos inmunocromatográficos encontramos Aspergillus lateral Flow device (LFD) (AspLFD® o OLM Diagnostics®) y Aspergillus galactomanano lateral Flow assay (GM-LFA) (IMMY inc.). El LFD en general  detecta un antígeno de manoproteína extracelular secretado exclusivamente durante el crecimiento activo de especies de Aspergillus a través del anticuerpo monoclonal JF5 del tipo de IgG, específico para esta glicoproteína de 40 kDa. Esta prueba, es rápida y su lectura puede efectuarse a los 5 minutos, para muestras de suero y LBA (15,18,32).

El Aspergillus GM-LFA utiliza dos anticuerpos monoclonales (MAb) diferentes, el MAb ME-A5, que se une a un epítopo GM similar al EBA-2 utilizado en los inmunoensayos de Platelia™, y un MAb no revelado. El segundo MAb, que detecta otros epítopos de GM, mejora la sensibilidad de Aspergillus GM-LFA en comparación con Platelia™. Sin embargo, la detección de otros epítopos también podría conducir a una disminución de la especificidad al permitir la reactividad cruzada con otros hongos, como especies de Scedosporium y Fusarium (18,35,36). Su procedimiento es fácil y rápido, además, de que las lecturas se hacen de forma visual, también se realizan mediante un lector de cubo sõna Aspergillus GM-LFA de la misma casa comercial para una mayor precisión (18,28,36,37).

El Aspergillus galactomannan Ag Virclia® (GM-VClia), es un monotest que utiliza una técnica basada en inmunoensayo quimioluminiscente indirecto (CLIA), para la detección cualitativa del antígeno galactomanano en muestras de suero y LBA. Es un protocolo simple a pesar de requerir un pretratamiento de las muestras, totalmente automatizado, que cuenta con todos los reactivos, controles y calibradores por muestra, arrojando resultados en 1 hora aproximadamente. Cuenta con una sensibilidad y especificidad del 93,8% y 89,5% respectivamente. Como desventaja, esta prueba solo puede ser usada en equipos de VIRCLIA® LOTUS, siendo costosa su adquisición y que posee una categoría de “dudoso”, siendo complicada su interpretación. (46,47) 

Es importante tener en cuenta las últimas recomendaciones del grupo EORTC/MSG para el uso de GM, ya que establecen diferentes valores del punto de corte para el test evaluado, ajustado a la muestra clínica, independientemente del grupo de pacientes, que difieren del valor de corte recomendado por el fabricante y aprobado por la FDA (21).

Detección de anticuerpos para Aspergillus spp.

Para la detección de anticuerpos de precipitación sérica bien sea de forma cualitativa o semicuantitativa de anticuerpos contra Aspergillus (es decir, subconjuntos de anticuerpos IgG e IgM), se utilizan técnicas de inmunodifusión en gel de agarosa (uno de ellos es ID Fungal Antibody System IMMY ®), de doble difusión, es decir, un anticuerpo y un antígeno, homólogos solubles que se dispersan en pocillos separados en un medio de difusión (gel de agarosa) que migran hacia la periferia, provocando un punto de encuentro entre los dos pocillos, donde se observará una línea visible de precipitado, obteniendo resultados positivos o de identidad, resultados negativos o no identidad y resultados indeterminados o de identidad parcial. (38). Figura 4.

Este tipo de técnicas de inmunodifusión, son útiles para el diagnóstico de aspergilosis broncopulmonar alérgica (ABPA) y aspergiloma, ya que se pueden observar en ambas un aumento de anticuerpos específicos logrando detectar el 70% de los casos de ABPA y más del 90% de los casos de aspergiloma; no son muy sensible para el diagnóstico de API, porque no existe una correlación entre el aumento de los títulos de anticuerpos anti-Aspergillus y la API (11,38). Existen pruebas de ELISA, que detectan IgG contra Aspergillus y son las pruebas de diagnóstico principal para aspergiloma y la aspergilosis pulmonar crónica (APC), pero carecen de especificidad en el diagnóstico de API. Inmunoglobulinas tipo IgG contra Aspergillus también están presente en la bronquitis por Aspergillus, nódulo por Aspergillus y la rinosinusitis crónica (11,38).

Reacción en cadena de la polimerasa

El análisis por PCR tiene potencial para el diagnóstico, pero como una alternativa para determinar la API, porque a nivel general tiene poca precisión, con una especificidad del 76 % y una gran cantidad de falsos positivos por la alta sensibilidad de las pruebas moleculares. El rendimiento de la PCR en sangre es particularmente deficiente en pacientes que reciben profilaxis activa contra hongos filamentosos (2,3).

Hay relativamente pocos ensayos de PCR comerciales, y la mayoría de los investigadores han desarrollado múltiples técnicas in-house de amplificación de ácidos nucleicos para detectar el ADN de Aspergillus con el fin de disminuir la heterogeneidad metodológica y mejorar el rendimiento diagnóstico, pero aún estas técnicas no se han incluido como criterio diagnóstico de API. Aun así, lo más relevante y útil de la PCR para Aspergillus, es que es capaz de detectar ciertas mutaciones asociadas con la resistencia a los triazoles directamente de LBA (19,28).

El ensayo comercial más utilizado es AsperGenius® (Pat-hognostics, Maastricht, NL), capaz de detectar ADN de los complejos A. fumigatus, A.terreus, A. flavus,

A. niger y A. nidulans en LBA, además de, cuatro genes que codifican resistencia a los azoles: TR34, L98H, Y121F y T289A (28). Otros ensayos menos utilizados son;

• OLM Diagnostics (AspID®): Diferencia Aspergillus

spp. de Aspergillus terreus (39).

•  BRUKER (Fungiplex® Aspergillus): PCR multiplex de tiempo real para diferenciar entre Aspergillus spp. (A. fumigatus, A. flavus y A. niger) con Aspergillus terreus, y junto con el kit Fungiplex ®Aspergillus Azole-R, se puede detectar la resistencia a los azoles por la mutación en el gen Cyp51, específica para Aspergillus fumigatus (40,41).

De igual forma, es recomendable que en el momento que se haga uso de los métodos moleculares, los resultados obtenidos, deben ser considerados junto con otras pruebas de diagnóstico, evaluando constantemente el contexto clínico de cada paciente en particular, por la falta de estandarización y validación de estas pruebas para el diagnóstico de API (3).

MALDI-TOF

La adaptación del proceso de preparación de aislados de hongos filamentosos para su identificación mediante MALDI-TOF ha sido mucho más lenta que la de las levaduras, debido a la dificultad de romper la pared celular de los hongos filamentosos para liberar las proteínas, así como la falta de representación de especies de importancia clínica en las bases de datos. Gracias al esfuerzo de diversos investigadores para desarrollar y evaluar distintos métodos de extracción de proteínas fúngicas, se ha ampliado el número de especies de hongos filamentosos con aislados clínicos para realizar la identificación de manera rutinaria utilizando MALDI-TOF (42,43).

Comercialmente, se dispone del VITEK® MS (bioMérieux S.A.) que proporciona los reactivos y consumibles necesarios para procesar muestras de hongos filamentosos pertenecientes a los géneros Aspergillus, Fusarium, Pseudallescheria/ Scedosporium y el orden Mucorales en cultivo sólido mediante la extracción e inactivación de sus proteínas. Debido al distinto patrón de proteínas expresado por los hongos filamentosos durante su crecimiento, es necesario establecer el momento en el que se realizará su identificación. Por ello, se recomienda que sea en los dos primeros días de crecimiento para evitar la presencia de esporas o de melanina, que dificultan su identificación (44).

En la actualidad las bases de datos comerciales continúan incorporando nuevos aislados. La base de datos de MALDI Biotyper® (MBT) y microflex® LRF (BRUKER) colocan a disposición de los usuarios (Filamentous Fungi Library 3.0) la base de datos VITEK MS (bioMérieux) versión IVD, que contiene una base con referencias de 116 especies, mientras que la versión RUO v4.15 Bruker contiene una base con referencias de 367 especies de 109 géneros (20,45). La identificación de hongos filamentosos a nivel de especie utilizando las plataformas comerciales de espectrometría de masas está entre el 40% y el 70% (40).

Usando estas bases de datos, se consigue identificar Aspergillus a nivel de especies, sección y clado, aunque se han reportado identificaciones erróneas entre Aspergillus thermomutatus, como A. fumigatus; A. calidoustus/pseudodeflectus como A. ustus; A. puniceus como A. ustus; y A. ustus y A, sydowii como A. versicolor (48,49).

CONCLUSIONES

La API es una de las causas más importantes de muerte en pacientes inmunocomprometidos. Gracias a los avances actuales, el diagnóstico de la API puede ser más rápido, específico y preciso, permitiendo disminuir la mortalidad causada por este hongo. Sin embargo, se debe continuar optimizando el diagnóstico mediante biomarcadores para disminuir falsos positivos y negativos en la determinación precoz de la enfermedad, así como tratar de normalizar la técnica de PCR. Además, ampliar las bases de datos a nivel de proteómica, MALDI-TOF para la identificación de más especies de Aspergillus y otros hongos filamentosos de interés clínico. Las optimizaciones de estas técnicas van a permitir una mayor capacidad diagnóstica y una orientación terapéutica adecuada para mejorar el pronóstico de esta infección.

CONFLICTO DE INTERÉS

Las autoras declaran no tener ningún conflicto de interés

FINANCIAMIENTO

No hubo financiamiento para la realización de este artículo.

REFERENCIAS

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