Espectrometría de Masas/Maldi-Tof y reacción en cadena de la Polimerasa: Técnicas Complementarias en la identificación de Biomoléculas

Introducción

En la actualidad, la investigación basada en biología molecular ofrece un inmenso campo de posibilidades para un mejor entendimiento de los fenómenos biológicos que nos rodean, valiéndose de técnicas cuyo fundamento es aislar ácidos nucleicos o extraerlos con alta pureza, visualizarlos, cortarlos, pegarlos, amplificar una región en una enorme cantidad de moléculas, cortar una determinada región con enzimas de restricción para determinar si por una mutación se gana o se pierde un sitio de restricción, entre otras múltiples variantes (1). Dichas técnicas poseen diversas aplicaciones, generalmente en el diagnóstico de enfermedades hereditarias, búsqueda de alelos o marcadores moleculares asociados a características de interés (2), detección y determinación de especies, genotipo y/o cepa de agentes patógenos humanos, entre otras (3). Las implicaciones que tiene este nuevo conocimiento abarcan campos tan diversos como la medicina, la conservación medio ambiental y la industrial (4,5).

La Reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) es el ejemplo clásico de los ensayos de amplificación de ácidos nucleicos, considerada hoy como una herramienta imprescindible en el laboratorio de biología molecular e ingeniería genética (6). Esta técnica está basada en el uso de cebadores y una enzima, ADN polimerasa termoestable (Taq polimerasa), que permite amplificar el segmento señalado por los cebadores (oligonucleótidos). Es un proceso cíclico de aproximadamente unas 40 repeticiones de tres pasos que suceden a diferentes temperaturas: desnaturalización, alineamiento o fijación de los cebadores y extensión. Esta progresión es controlada en el tiempo y por los cambios de temperatura (7).

Se han desarrollado variantes de la PCR que amplían su versatilidad dentro de las que se encuentran: PCR múltiple, RT-PCR, PCR anidada, PCR de extensión solapada (mutagénesis), PCR in situ, amplificación mediante activación progresiva de la polimerasa, amplificación con rampa decreciente de temperaturas, amplificación asimétrica, amplificación cuantitativa (PCR en tiempo real), amplificación en chips. Hoy existen sistemas capaces de realizar ambas funciones, tanto la RT como la polimerización del ADN, y entonces el proceso se denomina RT-PCR (6). Después de la amplificación el producto de la PCR puede ser detectado por medios, como la electroforesis en gel de agarosa o la electroforesis capilar (5,7).

En este contexto, aun cuando es indiscutible el papel de la PCR para la investigación de diversos organismos de interés clínico, el surgimiento de técnicas basadas en principios físicos-químicos o destinados originalmente a otras aplicaciones pueden aumentar o complementar la eficiencia de dichas técnicas en el diagnóstico clínico. En este sentido, la espectrometría de masas de desorción/ionización láser (MALDI-TOF SM) por sus siglas en inglés, es capaz de analizar cualitativa y cuantitativamente mezclas complejas de diversas sustancias. Asimismo, esta técnica también permite determinar la masa molecular de un compuesto y la de los diversos fragmentos que resultan de la rotura del mismo, proporcionando información sobre la estructura del compuesto inicial (8).

El análisis de perfiles de proteínas mediante MALDI-TOF SM, ha permitido en el campo de la proteómica comparar los espectros de masas obtenidos por dicha técnica con una base de datos biológica de proteínas (9) cuya secuencia se conoce o bien de información genómica, esto es, mediante un enfoque in silico. Para esto, se emplean herramientas de software capaces de traducir las secuencias nucleotídicas del genoma, depositadas en la base de datos, a secuencias de aminoácidos (esto es, los componentes de las proteínas); luego, se corta teóricamente la secuencia de la cadena polipeptídica y se calculan las masas absolutas de los péptidos obtenidos (10). Dicha comparación entre huella de tamaños de péptidos obtenida con las depositadas en la base de datos permite asociar estadísticamente la proteína desconocida con la más semejante de la base de datos (asociación que puede ser de identidad) (11). Específicamente, la huella peptídica es única para cada microorganismo, lo que permite identificarlo (12).

Desde hace treinta años, la espectrometría de masas se ha utilizado como una herramienta poderosa para el análisis y la caracterización de proteínas. Sin embargo, es sólo recientemente que esta tecnología, especialmente MALDI-TOF MS, ha entrado en el campo de la microbiología clínica habitual (11,13), permitiendo un diagnóstico más fácil y rápido de patógenos humanos que a través de los métodos de identificación molecular y fenotípica convencional, con una fiabilidad incuestionable y una relación coste-eficacia favorable. Actualmente, se ha convertido en una alternativa no solo para el diagnóstico temprano de enfermedades infecciosas sino también para estudios epidemiológico que favorecen nuevas estrategias de prevención y control, sin desplazar la biología molecular, más bien complementándola (14). Aunado a esto, MALDI-TOF SM se está desarrollando como alternativa a la electroforesis en gel para visualizar fragmentos de ADN generados de forma análoga al procedimiento seguido en el método de secuenciación Sanger y que pueden ser diferenciados en función de su masa, de manera que los polimorfismos de un solo nucleótido pueden ser detectados por la diferente masa de los distintos nucleótidos que formen la secuencia de ADN en cada caso (15).

Con base en lo anteriormente expuesto, a continuación, se presenta una revisión sobre la aplicación de MALDI-TOF SM en la identificación de microorganismos, bien sea caracterizados a través de técnicas moleculares o métodos convencionales.

Espectrometría de masas de desorción/ionización láser (MALDI-TOF SM)

La espectrometría de masas (EM) es una técnica microanalítica usada para identificar compuestos desconocidos, cuantificar compuestos conocidos, y para elucidar la estructura y propiedades químicas de las moléculas. Requiere cantidades pequeñas de muestra y obtiene información característica como el peso y algunas veces la estructura del analito. En la EM la muestra es ionizada (y por tanto destruida) usando diversos procedimientos para ello. De todos ellos el más usual y/o utilizado es la técnica denominada de Impacto Electrónico consistente en el bombardeo de la muestra (previamente vaporizada mediante el uso de alto vacío y una fuente de calor) con una corriente de electrones a alta velocidad (11).

Mediante este proceso, la sustancia pierde algunos electrones y se fragmenta dando diferentes iones, radicales y moléculas neutras. Los iones (moléculas o fragmentos cargados) son entonces conducidos mediante un acelerador de iones a un tubo analizador curvado sobre el que existe un fuerte campo magnético y conducidos a un colector/analizador sobre el que se recogen los impactos de dichos iones en función de la relación carga/masa de los mismos. Cada compuesto es único, y cada uno de los compuestos se ionizará y fragmentará de una determinada manera, y en este principio se basa la espectrometría de masas para identificar cada analito (16).

El MALDI-TOF MS utiliza el cálculo de tiempo de migración (tiempo de vuelo) de cada fragmento de una molécula a través de un trayecto predeterminado previa desorción/ionización láser de la molécula en una matriz determinada (17). Este espectrómetro tiene la capacidad de medir macromoléculas de hasta 100.000 Dalton, dentro de las cuales están los péptidos y proteínas que forman parte de microorganismos. Dado que un microorganismo analizado en el MALDI-TOF MS presentará siempre el mismo espectro de masas, los fabricantes de los sistemas MALDI-TOF MS han diseñado archivos con los espectros de masas de la fragmentación de péptidos y proteínas que presentan estos para una misma emisión del láser y una misma distancia de migración. La identificación se realiza a través de la comparación (correlación) del resultado del microrganismo con todos los espectros de masas que contiene el archivo comercial proporcionado por el fabricante, y de acuerdo a puntos de corte definidos para estas correlaciones (18). Estos archivos junto con los programas informáticos necesarios para su manejo permitieron finalmente el uso de esta herramienta en el campo de la microbiología clínica.

MALDI-TOF SM y microbiología

Está claro que la PCR está reemplazando el aislamiento de virus o el cultivo de bacterias para la detección de agentes que son difíciles o imposibles de cultivar. Hay varias razones para esta tendencia, teniendo en cuenta que el aislamiento requiere la presencia de los microorganismos que se replican (virus o bacterias), cultivos celulares costosos y el mantenimiento de las instalaciones, hasta varias semanas para completar el diagnóstico en algunas ocasiones y una pericia especial que se está perdiendo o disminuyendo hoy en muchos laboratorios. Aunque los ensayos de la PCR inicialmente eran caros y engorrosos, hoy en día son herramientas relativamente accesibles, seguras y fáciles de utilizar en los laboratorios de diagnóstico.

Por su parte, MALDI-TOF MS se puede utilizar para la identificación precisa y rápida de diversos microorganismos tales como bacterias Gram–positivas, enterobacterias, levaduras, bacterias no fermentadoras (12), anaerobias (13) y micobacterias (19). La ventaja sorprendente del método de espectro de masas sobre procedimientos fenotípicos y genotípicos es la preparación simple de la muestra encorto tiempo para el análisis (20-22) y existen proyecciones de innovaciones a esta técnica que la harán más versátil ampliando su utilidad diagnóstica en cuanto a matrices (23).

MALDI-TOF MS permite la identificación de microorganismos mediante el análisis de proteínas, principalmente ribosomales (24), a partir de colonias; este análisis conduce a la creación de un espectro de masas que es específico para cada especie (22, 25). La identificación de los microorganismos por MALDI-TOF MS se basa en que las huellas digitales espectrales varían entre los microorganismos, algunos picos son específicos del género, otros de la especie y otros, a veces, de las subespecies (11). No obstante, los datos publicados en relación con ciertos grupos de microorganismos son todavía controvertidos (22).

En general, los sistemas de identificación de MALDI-TOF MS han recibido la aprobación de la FDA (26), existen dos grandes fabricantes que comercializan esta tecnología, una de ellas es Bruker Daltonics, Bremen (Alemania) (27) cuya técnica se describirá a continuación pues en general ilustra el procedimiento. Para la preparación de la muestra se requiere un inoculo tomado a partir de una colonia aislada en cultivo puro, el cual se deposita por duplicado sobre una tarjeta de análisis y se deja secar a temperatura ambiente. Luego, los pocillos son cubiertos con la matriz (solución saturada de ácido a-ciano-4-hidroxicinámico en 50% acetonitrilo y 2,5% ácido trifluoro-acético. Los parámetros del equipo se ajustan según recomendaciones del fabricante. Para la calibración del espectrómetro se utiliza una prueba estándar consistente en el perfil proteico de una cepa de Escherichia coli DH5 péptido alfa, que posee proteínas adicionales (BTS; Bruker Daltonics). El estándar BTS se utiliza también como control positivo para validar la corrida. Los espectros para cada aislado se obtienen con 240 disparos del láser en seis regiones distintas en el mismo pocillo y dichos espectros son analizados por el software IMALDI Biotyper RTC 3.0. Los espectros son creados considerando el tiempo requerido por las proteínas para llegar al detector lo que depende de la relación masa/carga de éstas. Cada espectro al ser comparado con la base de datos permite la asignación de un puntaje. Los criterios de identificación señalados por el fabricante son los siguientes: puntaje > 2,000 indica identificación a nivel de especie, puntaje entre 1,700-1,999 indica identificación confiable sólo a nivel de género, mientras que valores < 1,700 no permiten identificación (13, 15,20-22).

Cuando se requiere la extracción, se realiza con etanol/ ácido, donde 2-3 colonias aisladas se transfirieren con un asa de siembra o punta de la pipeta al tornillo tubo de extracción y se mezclan en 300 ml de agua doblemente destilada. Se añade etanol absoluto (0,9 ml), el contenido del tubo se mezcla con cuidado, y los tubos se centrifugan a 13.000 g durante 2 min; se descarta el sobrenadante y el sedimento se seca al aire. Aproximadamente 10 ml de la pastilla se mezclan con 50ml de ácido fórmico (70%), antes de la adición de un volumen equivalente de acetonitrilo. La mezcla se centrifuga a 13.000 g durante 2 min y 1 ml del sobrenadante se coloca sobre una placa diana MALDI de acero y se deja secar a temperatura ambiente. Posteriormente, cada muestra se cubre con 1 ml de solución de matriz, que consiste en una solución saturada de a-ciano-4 ácido hidroxi-cinámico (HCCA) en 50 por ciento de acetonitrilo y 2,5 por ciento ácido trifluoroacético (concentración final: 10 mg HCCA/ ml) y se seca al aire a temperatura ambiente (13, 20, 28).

El uso de esta técnica puede evidenciarse en diferentes estudios, por ejemplo, Bizzini et al (2010), compararon a MALDI-TOF MS con el método convencional fenotípico para la identificación de los aislados de rutina. Las colonias se analizaron por MALDI-TOF MS, por deposición directa sobre la placa diana o después de una etapa de extracción de ácido fórmico-acetonitrilo. Entre 1.371 aislados identificados por métodos convencionales, 1.278 (93,2%) fueron identificados a nivel de especie por MALDI-TOF MS y 73 (5,3%) se identificaron a nivel de género, mientras que en 20(1,5%) no hubo identificación fiable. Los autores señalan que se requiere una etapa de extracción para obtener una identificación MALDI-TOF MS válida para el 25,6% de las 1.278 cepas válidas. En conclusión, los resultados de esta investigación muestran que MALDI-TOF MS es una técnica rápida y fiable, que tiene el potencial de reemplazar la identificación fenotípica convencional para la mayoría de las cepas bacterianas aisladas de forma rutinaria en los laboratorios de microbiología clínica (20).

Panda et al, en el 2014, identificaron aislamientos bacterianos clínicos mediante perfiles de proteínas utilizando MALDI-TOF MS. Los aislamientos bacterianos recién cultivados fueron seleccionados de placas de cultivo. La identificación se hizo según la técnica de Bruker Daltonik Gmb H, Bremen, Alemania, empleando el software MALDI Biotyper 1.1, para la identificación microbiana. Se llevó a cabo un análisis comparativo de 82 aislamientos bacterianos clínicos usando MALDI-TOF MS y técnicas convencionales. Entre los aislados clínicos, la precisión a nivel de especie para los aislamientos fue de 98,78%. Uno de los 82 aislados no concordaba con los ensayos convencionales dado que MALDI-TOF MS identificó un Streptococcus pneumoniae y por métodos convencionales se identificó como Streptococcus viridans. MALDI-TOF MS resultó ser un sistema preciso, rápido, rentable y robusto para la identificación de los aislamientos bacterianos clínicos (21).

Por otra parte, en lo que concierne al empleo de métodos moleculares para detectar los mecanismos de resistencia, éstos se desarrollan mediante diferentes estrategias: a) hibridación ADN-ADN con una sonda de ADN marcada con fluorescencia; la metodología consiste en la identificación de una secuencia específica de ADN (gen que codifica a una resistencia) mediante el reconocimiento de la secuencia homóloga en el ADN en varias muestras clínicas o bacterianas; b) amplificación por PCR de un gen específico; esta técnica amplía en forma exponencial un gen específico de interés (p. ej., b-lactamasas); c) polimorfismo de fragmentos largos de restricción (RFLP), que se basa en el análisis del patrón de restricción de los fragmentos de ADN generados por una enzima de restricción que previamente se amplificaron por PCR (6); esta prueba puede detectar mutaciones puntuales en el ADN que alteren el número de sitios de restricción de la enzima empleada; d) secuenciación nucleotídica de ADN, que consiste en la identificación de la secuencia de las cuatro bases que componen el ADN mediante una síntesis de ADN in vitro (técnica de Sanger); esta secuencia puede utilizarse para inferir la secuencia de aminoácidos que componen a la proteína que codifica este ADN e identificar las posibles alteraciones (mutaciones) al compararse con el gen silvestre. En la actualidad se utilizan nucleótidos marcados con fluorescencia que permite una secuenciación de ADN automatizada y de alto rendimiento (29).

Con respecto a la proteómica, se ha utilizado la espectrometría de masa para identificar polimorfismos y genotipificación de diferentes proteínas en una sola muestra (30, 31). En cuanto al área de la bioinformática, se ha desarrollado una gran cantidad de bases de datos con información biomédica y asimismo se han realizado programas computacionales empleados para establecer las vías de evolución de los genes que codifican a las b-lactamasas de distribución mundial (30).

Chan et al (2015), proponen un protocolo para la detección de estafilococos resistentes a meticilina y vancomicina, el cual consiste en combinar el poder de discriminación de especies de MALDI-TOF MS y la capacidad de multiplex en PCR de tiempo real con análisis de la curva de fusión (PCR-MCA) en aislamientos clínicos y hemocultivos positivos. En primer lugar, MALDI-TOF MS se utilizó para la detección de aislados clínicos sospechosos o hemocultivos positivos. Si se identificaban especies de Staphylococcus o Enterococcus, la misma muestra se sometía a PCR-MCA para la detección de genes relacionados de resistencia/citotóxica a antibióticos, incluyendo genes en una reacción triple para mecA, mecALGA251 y leucocidina Panton-Valentine (PVL) de cultivos de estafilococos aislados de doble PCR del gen mecA / mecALGA251 y los genes nuc para cultivos de sangre de estafilococos y los genes vanA y vanB en una reacción de dúplex en enterococos. El tiempo total de ensayo fue <2,5 h. Los resultados revelaron 100% de concordancia con las pruebas de sensibilidad a los antibióticos u otros métodos de referencia para todos los aislados de cultivo y cultivos de sangre de enterococos. El porcentaje de concordancia para estafilococos de hemocultivos fue del 97,5%. Este estudio concluye que el método evaluado fue rápido, económico, fiable y capaz de detectar genotipos mecALGA251, vanB1 y vanB2, que no están incluidos en la mayoría de los ensayos comerciales. Se requiere el cribado a gran escala para probar aún más el rendimiento de este protocolo, sobre todo para los genotipos que se encuentran con poca frecuencia (32).

MALDI-TOF SM y Virus

Tradicionalmente, el método estándar de oro para la detección directa de los virus es el cultivo de células, aunque el uso de este método a menudo requiere varios días o semanas antes de que se puedan obtener los resultados. La microscopía electrónica y los métodos de detección directa de antígenos basado en inmunoensayo enzimático o inmunofluorescencia son ampliamente utilizados para la detección y / o identificación del virus, aunque algunas de estas técnicas son menos sensibles que el cultivo celular. Por último, las técnicas de amplificación génica basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) proporcionan una alternativa rápida y sensible para la detección y/o identificación de virus (33, 34).

La detección y/o identificación de virus tradicionalmente se basan en los métodos basados en el cultivo de células, microscopía electrónica y detección del antígeno o ácido nucleico. Estas técnicas son buenas, pero a menudo costosas y requieren mucho tiempo; Por otra parte, no siempre conducen a la identificación del virus a nivel de especies o del tipo. Calderaro et al en el 2014, en Italia estudiaron MALDI-TOF MS para identificar los poliovirus humanos e identificar biomarcadores específicos de la proteína viral en las células infectadas. Los resultados revelaron que dicha técnica es una herramienta eficaz y de bajo costo para la identificación de los tres serotipos de poliovirus. El método se aplicó en primer lugar a cepas de referencia Sabin, y luego a los aislados de diferentes muestras clínicas, y se comparó con el ensayo de neutralización (patrón de oro) (35).

Los poliovirus presentan diferentes proteínas de la cápside, que confieren la especificidad del receptor celular y antigenicidad. El poliovirus tipo 1 es el serotipo más común encontrado en la naturaleza; sin embargo, los tres serotipos son extremadamente infecciosos y peligrosos, siendo los agentes causantes de la poliomielitis. Una de las principales ventajas de este enfoque es la identificación de cepas de poliovirus mediante análisis MALDI-TOF MS ya que se puede obtener después a 5 días-procedimiento (a partir de la observación de un efecto citopático en el cultivo de la muestra), acortando considerablemente el tiempo necesario para llevar a cabo la prueba de neutralización (que requiere aproximadamente 20 días). Esto confirma la capacidad de la plataforma de MALDI-TOF MS de acortar significativamente los tiempos para los métodos de identificación convencionales en algunos casos y, por otra parte, la reducción significativa de los costos de reactivos y la necesidad de personal con experiencia (35).

PCR y MALDI-TOF SM en parasitología

Durante las últimas décadas, el estudio a nivel molecular de los parásitos que afectan a los humanos o a sus cultivos y producciones animales ha sido uno de los frentes más activos en parasitología clínica y aplicada. De hecho, hoy en día se ha secuenciado ya el genoma completo de algunos parásitos de especial importancia socioeconómica, como el que causa la malaria humana (Plasmodium falciparum) (3). En este sentido, las técnicas para poder detectar y caracterizar el ADN de un patógeno continúan mejorando y desarrollándose. El procedimiento discriminatorio fundamental es la secuenciación del genoma (3). Las técnicas tales como el RFLP, el PCR-RFLP, el RAPD-PCR continuarán desempeñando un papel central en la identificación y discriminación de los aislamientos de la mayoría de los patógenos (4), sin embargo técnicas simples como la PCR convencional continúan demostrando su utilidad, sobre todo en países en desarrollo, donde acceder a equipos de última tecnología puede ser difícil.

La biología molecular, incluyendo técnicas de genotipaje diversas y sobre todo de secuenciación de ADN, ha conllevado una total revolución y la necesidad de revisar muchísimos de los conceptos e ideas sobre evolución de los diferentes grupos parásitos de lo que se sabía hasta hace poco. Merecen especial mención la gran utilidad de los diferentes y numerosos marcadores tanto del ADN ribosomal como del ADN mitocondrial, dadas las valiosísimas y muy útiles características de la multiplicidad repetitiva de los genes y especiadores como la evolución concertada de estos dos tipos de marcadores genéticos, que los convierten en idóneos para este tipo de estudios. La aplicabilidad de estas técnicas se muestra a diferentes niveles. Ya no únicamente para analizar la evolución de grupos de parásitos completos o de conjuntos de especies bien próximas y emparentadas, bien más o menos lejanas, sino también para el estudio de fenómenos microevolutivos locales (36), como sucede en fenómenos de hibridación entre especies de parásitos muy próximos detectables mediante haplotipaje combinado jugando con genes y especiadores diversos y análisis de microsatélites y de introgresión (37).

En cuanto a la técnica MALDI-TOF MS, hasta ahora se ha limitado a la obtención de datos del proteoma parasitario general, para la caracterización de biomarcadores específicos con el fin de discriminar entre especies de Cryptosporidium y Giardia. Además de esto, Martiny et al. (2014), evaluaron su posible aplicación para diferenciar subtipos de Blastocystis. En relación a esto, una base de datos con señales de proteínas parasitarias fue construido para cinco subtipos de Blastocystis, y los espectros de referencia se compararon con los de 19 cultivos axénicos de ST1, ST2, ST3, ST4 y ST8 y nueve cultivos xenicos líquidos con ST3 y ST4. Las muestras de los cultivos axénicos se prepararon utilizando la extracción con ácido fórmico estándar. Los espectros de referencia revelaron cinco perfiles espectrales diferentes, y la biblioteca de base de datos permitió la discriminación entre todos los cultivos con índices de fiabilidad que van desde 2,038 hasta más de 2,8 cuando se realizó una extracción. El procedimiento de deposición directa como resultado una mayor variabilidad en la discriminación y la identificación directa de MALDI-TOF MS a partir de cultivos líquidos xenicos fue eficaz en 3 de 9 muestras. MALDI-TOF MS resultó ser una tecnología eficaz para discriminar eficazmente subtipos de Blastocystis en cultivos axénicos (38).

Cassagne et al (2014) en Francia, lograron identificar, a nivel de especie, los promastigotes de Leishmania de cultivo in vitro. Primero construyeron una base de datos de referencia de espectros incluyendo las principales especies que causan la leishmaniasis humana. El rendimiento de la base de datos de referencia en la identificación de promastigotes de Leishmania se probó en un panel de 69 aislados obtenidos de pacientes. Los autores identificaron correctamente 66 de las 69 cepas probadas a nivel de especie, con un registro (puntuación) de valores superiores a 2. Dos aislamientos de Leishmania produjeron patrones no interpretables por MALDI-TOF MS, debido a los bajos valores de registro (puntuación). Sólo una cepa de Leishmania peruviana se ha identificado erróneamente como las especies estrechamente relacionadas Leishmania braziliensis, con un registro (puntuación) de 2.399. MALDI-TOF MS es un enfoque prometedor, pues proporciona la identificación rápida y precisa de Leishmania a partir del cultivo in vitro a nivel de especie (39).

Por otra parte, Calderaro et al (2015), realizaron un estudio para la identificación y diferenciación de E. histolytica y E. dispar por MALDI-TOF MS, con el fin de evaluar la aplicación de esta técnica en la práctica de diagnóstico de rutina. MALDI-TOF MS se aplicó a 3 cepas de amibas de referencia y 14 cepas aisladas de heces que habían sido diferenciadas por métodos moleculares. Los extractos de proteína a partir de cultivos de estas cepas en medio mínimo (para las cepas de referencia y cultivos monoxénicos para los aislamientos) se analizaron por MALDI-TOF MS y los espectros obtenidos se analizaron mediante el software estadístico. Cinco picos que discriminan entre cepas de referencia de E. histolytica y E. dispar fueron encontrados por el análisis del perfil de proteínas: 2 picos (8.246 y 8.303 Da) específicos para E. histolytica y 3 (4,714; 5,541; 8,207 Da) de E. dispar. Todos los aislados clínicos excepto uno mostraron los picos esperados discriminantes para las especies apropiadas. Este estudio muestra que MALDI-TOF MS puede ser utilizado para discriminar entre E. histolytica y E. dispar utilizando cultivos in vitro xenicos y también podría tener potencial para la detección de estas especies en muestras clínicas (40).

Limitaciones de MALDI-TOF SM

Entre las limitaciones de MALDI-TOF SM se puede señalar que tanto el material, como todas las superficies requieren estar extremadamente limpias. Los contaminantes más frecuentes son queratina humana y BSA. La queratina proviene del polvo, pequeños pelos o pelusas y huellas de dedos. Un pequeño pelo contiene cantidades abrumadoras de queratina comparado con la cantidad de proteína de la muestra. Por otra parte, cada espectro de referencia de las bibliotecas se ha creado con especies microbianas individuales, lo cual limita el potencial de discriminacion de la especie cuando se trata de cultivos polimicrobianos (19). Es decir, proporciona una idea general de las especies microbianas dominantes en una muestra de cultivo polimicrobiano, pero con información limitada sobre las especies microbianas residuales. Esto puede explicarse debido a que si las muestras tienen varios componentes, estos competirán por los protones en el proceso de ionización y encontraremos señales más altas de los componentes que están a mayor concentración, mientras que los de baja concentración darán señales débiles que pueden ser eliminadas en el procesado del espectro de masas.

Conclusión

En la actualidad, existe una necesidad crítica de desarrollar métodos precisos, específicos, de alto rendimiento y bajo costo para el diagnóstico de enfermedades infecciosas, las pruebas de PCR han tenido una enorme proyección como herramienta útil y extremadamente sensible en investigación biomédica, industrial y biológica. Por su parte, la espectrometría de masas MALDI-TOF se ha convertido en un recurso de referencia para la identificación de microorganismos. Se evidencia en diferentes investigaciones, la comparacion en cuanto a los porcentajes de identificaciones por MALDI-TOF MS e identificación convencional o con PCR, donde en algunos casos se observa que la espectrometría de masas es un método más confiable que los utilizados actualmente en el laboratorio para el mismo fin. De manera similar al comparar los costos, cada identificación cuesta en promedio ocho veces menos que la convencional. Una de los características más novedosas de la MALDI-TOF MS, es la obtención de mapas de concentración de analitos sobre cortes de tejido o distintos tipos de superficies orgánicas o inorgánicas. Esto permite describir la distribución espacial de un compuesto químico en una muestra sin apenas tratamiento previo (tejido, célula, material sintético),con una resolución de unas pocas decenas de micras. Por otra parte, esta técnica constituye una herramienta complementaria a las moleculares y en casos como el análisis de polimorfismos de secuencias en genes relacionados con resistencia bacteriana tiene excelentes resultados.

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