Métodos cromatográficos en el análisis de biomarcadores de exposición a contaminantes ambientales

Introducción

Los contaminantes antropogénicos (emisiones industriales y el uso de productos químicos), impactan significativamente la salud humana y los ecosistemas (1), estos se encuentran en diversos compartimentos ambientales representando un desafío global en términos de monitoreo y control. Estimar el riesgo de exposición mediante proyecciones y modelos matemáticos derivados de la monitorización ambiental es una de las opciones frecuentemente utilizadas (2). No obstante, esto constituye una medición indirecta por lo que la biomonitorización humana es reconocida como la medición directa de la exposición a sustancias catalogadas como prioritarias debido a su amplia presencia en el medio ambiente y a su toxicidad (3-4). La biomonitorización requiere métodos que impliquen la medición sensible y precisa de biomarcadores asociados al exposoma, en fluidos biológicos o matrices ambientales (5). Estas mediciones deben ser validadas en procesos de selección y aprobación, teniendo en cuenta aspectos como la especificidad, fiabilidad, sensibilidad y medida de riesgo de éstos, estableciéndose la exactitud, precisión y la calidad del procedimiento analítico (6).

La cromatografía es uno de los métodos de mayor utilidad en la evaluación ambiental y el monitoreo biológico. Permite la separación, identificación y determinación de los componentes químicos en mezclas complejas (7). En los últimos años, ha habido un notable avance en las tecnologías cromatográficas, incluyendo mejoras en la resolución, velocidad y sensibilidad de los métodos. La introducción de nuevas fases estacionarias y el acoplamiento con técnicas como la espectrometría de masas han ampliado las aplicaciones de la cromatografía, permitiendo el análisis más preciso de mezclas complejas (8). Cabe decir que, los sistemas analíticos instrumentales utilizados para el análisis cromatográfico han sido muy variados y de diferente naturaleza, estos han permitido alcanzar límites de detección tan bajos, que es difícil encontrar muestras blanco, libres del compuesto a analizar, dado su carácter ubicuo (9-11).

Un aspecto relevante en las fases analíticas de biomarcadores son las matrices, las más utilizadas en la actualidad son las tradicionales (orina, sangre), sin embargo, existe un permanente interés en la búsqueda de alternativas menos invasivas. Recientemente se han propuesto otras con mayor estabilidad, como pelo, uñas, leche materna, saliva, meconio y aire exhalado (12-15), además, se han planteado matrices alternativas, cuya validez se encuentra en estudio (16, 17) y serán desarrolladas ampliamente en esta revisión.

Otro aspecto considerado relevante en esta investigación, es la fase pre-analítica, dado que la identificación y determinación cuantitativa de los contaminantes y/o sus metabolitos en las mencionadas matrices biológicas, requiere de una instrumentación adecuada (18). Este paso de preparación de la muestra se aplica principalmente para eliminar las interferencias de la matriz, realizar la limpieza de la muestra y preconcentrar los compuestos diana, a fin de minimizar la complejidad de la muestra antes de su inyección en el cromatógrafo, lo que puede mejorar la señal de respuesta del analito (19, 20).

Lo antes expuesto pone en evidencia que las técnicas cromatográficas y su aplicación en la toxicología ambiental constituyen un área de conocimiento en constante desarrollo. Durante las últimas tres décadas, se han cuantificado varios cientos de biomarcadores de exposición. Particularmente persisten desafíos en la optimización de las fases preanalíticas y en la validación de métodos analíticos sostenibles y precisos.

Esta revisión aborda estos retos, examinando los contaminantes ambientales desde el enfoque de la biomonitorización, así como los biomarcadores de mayor importancia. Finalmente se destacan los avances más recientes en técnicas cromatográficas aplicadas en dichos análisis químicos-toxicológicos, con el fin de proporcionar una visión integral de los criterios a considerar en la selección de los biomarcadores, sus matrices y la técnica idónea para la medición de estos. Criterios de búsqueda y extracción de datos Se desarrolló una revisión de alcance con el propósito de actualizar la información acerca de los métodos cromatográficos empleados para la determinación de biomarcadores de exposición ambiental

(21,22), enfocando la investigación en estudios de biomonitorización realizados en personas expuestas ambientalmente. Esta revisión se enmarca dentro de un enfoque cualitativo y se adscribe a la línea de investigación de Tóxicos ambientales de la Unidad de Investigación en Toxicología Molecular de la Escuela de Bioanálisis-Sede Carabobo.

Se realizó una búsqueda extensa sobre los avances e innovaciones en métodos cromatográficos utilizados en el análisis de biomarcadores de exposición a contaminantes ambientales en las bases de datos Web of Science, SCIELO y PubMed. Complementados con filtros de temporalidad y criterios lingüísticos, estos recursos garantizan acceso a literatura actualizada, arbitrada y representativa, para optimizar la pertinencia de los estudios seleccionados. Se utilizaron términos de búsqueda estandarizados como “Chromatography”, “Exposure Biomarkers”, “Environmental Toxicology”, “Cromatografía”, “Biomarcadores”, y “Toxicología Ambiental”, junto con operadores booleanos como AND y comillas para frases exactas. Primero, se identificaron publicaciones que mencionaban términos relevantes; luego, se seleccionaron artículos cuyo resumen indicara una contribución significativa al tema. Los criterios considerados para incluir artículos en esta revisión de alcance se basaron en la selección de estudios originales realizados en población humana, acerca de biomarcadores de exposición a contaminantes ambientales, determinados mediante cromatografía y publicados en revistas especializadas, arbitradas e indexadas en bases de datos reconocidas, a partir de 2015. No se consideraron artículos incompletos, publicaciones no indexadas, páginas web, artículos no relacionados directamente con el tema, así como los publicados en idiomas diferentes del español, portugués o inglés.

Para el análisis de la calidad metodológica y selección final se aplicó una lista de verificación (23), evaluando aspectos clave como claridad en la descripción de los métodos cromatográficos, esto es, si los estudios describían detalladamente las fases analíticas y preanalíticas. También se consideró la relevancia de los biomarcadores estudiados, en tanto su pertinencia para el tipo de exposición analizada y la adecuación de la muestra en relación con su tamaño y selección; finalmente, la consistencia en la presentación de resultados, considerando que estuvieran presentados de manera clara y coherente con los objetivos del estudio.

Resultados de la búsqueda

La búsqueda en las tres bases de datos seleccionadas resultó en un total de 690 artículos relacionados con el tema de esta investigación, después de eliminar los duplicados, se obtuvo un conjunto final de 274 artículos. Con esta selección previa, se procedió a revisar los títulos, excluyendo aquellos que no se alineaban con el objetivo de la revisión, conservando 108 artículos para una revisión más detallada.

Posteriormente, se examinaron los resúmenes de estos últimos y se seleccionaron aquellos que abordaban específicamente el enfoque ecotoxicológico, y que detallaban el uso de los métodos cromatográficos en la determinación de biomarcadores de exposición a contaminantes ambientales. Esta selección redujo el número de estudios a 88, de los cuales solo 70 estaban disponibles para su descarga y revisión completa. Finalmente se realizó una segunda búsqueda a partir de las referencias de los artículos seleccionados. Tras la lectura detallada, se identificaron 76 estudios que se ajustaban plenamente a los criterios establecidos para esta revisión y que constituyen la base de los resultados presentados, el proceso completo de selección de la literatura se resume en la Figura 1.

Los estudios incluidos en esta revisión se caracterizaron por su enfoque en la aplicación de métodos cromatográficos, como la cromatografía líquida y de gases, en la detección y cuantificación de biomarcadores de exposición a diversos contaminantes ambientales. La mayoría de los estudios seleccionados emplearon técnicas avanzadas de preparación de muestra y análisis cuantitativo, lo que les permitió alcanzar límites de detección muy bajos y una alta especificidad en la identificación de los biomarcadores.

Síntesis y análisis

Estudios de Biomonitoreo humano

Con el fin de evaluar la exposición a xenobióticos y los efectos sobre la salud, así como la susceptibilidad individual, se desarrollan los estudios de biomonitoreo humano (HBM), un enfoque que fue introducido hace más de tres décadas y que abarca varios pasos químicos y biológicos, comenzando  con la medición externa, que incluye el aire, los alimentos, el agua, el suelo y el polvo; luego se evalúa la exposición interna, que ocurre a través de la inhalación, ingestión o absorción dérmica, como en el caso de la presencia del compuesto original o sus metabolitos en sangre u orina; otros estudios evalúan la dosis biológicamente efectiva, que puede observarse, por ejemplo, mediante la formación de aductos en proteínas ó ADN (24). 

Finalmente, también se miden los efectos biológicos tempranos, como la aparición de micronúcleos, o tardíos, como cambios en la estructura o función celular, desarrollo de tumores u otras enfermedades. Este enfoque del biomonitoreo ha sido simplificado en un esquema que se centra en la búsqueda de resultados adversos (25). Según esto, se resume en las fases exposición (absorción, distribución, metabolismo y excreción), los eventos moleculares iniciales, los eventos clave tempranos y los eventos clave tardíos, tal como se observa en la figura 2.

Contaminantes ambientales y potenciales efectos tóxicos

Los contaminantes ambientales representan una amenaza significativa para la salud humana, ya que la exposición a ellos es constante y a través de diversas fuentes. Estos contaminantes, que pueden encontrarse en el aire, agua, suelo y alimentos, pueden ser absorbidos por el organismo a través de la inhalación, ingestión o contacto dérmico (26). Para evaluar el grado de exposición y sus posibles efectos adversos, se han identificado una serie de biomarcadores específicos que permiten medir la presencia y el impacto de estos contaminantes en el cuerpo humano.  En la tabla 1 se presentan contaminantes ambientales considerados los más importantes para el desarrollo de estudios de biomonitoreo humano en la Unión Europea y los biomarcadores relacionados con la exposición a estos compuestos (27). No se conoce que esta iniciativa se haya desarrollado para América Latina.Se ha estudiado la asociación de la exposición a PFAS con la expresión de proteínas vinculadas a la inflamación, inmunidad y estrés oxidativo (35), también se han relacionado los niveles altos de PFAS con enfermedades cardiovasculares (36); diversos autores exponen que las alteraciones en el perfil proteómico podrían proporcionar una visión de los posibles mecanismos moleculares de la toxicidad de los PFAS (38,49). Del mismo modo, se han relacionado altos niveles de dioxinas con la alteración de varios procesos biológicos, incluyendo el metabolismo de glicerofosfolípidos y la interconversión de pentosa y glucuronato (50), encontrando niveles más altos de dioxinas en el suero de pacientes con diabetes.

Por su parte, los Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos están clasificados como carcinógenos del grupo 1A , y se reconoce su presencia en emisiones vehiculares y material particulado (51); en relación con esto, se ha demostrado que la exposición materna a la contaminación  del aire relacionada con el tráfico, durante el embarazo, aumenta el riesgo de resultados adversos en el nacimiento y trastornos del neurodesarrollo, por alteración de vías relacionadas con el estrés oxidativo y la inflamación, incluyendo las vías del linolenato, leucotrienos y prostaglandinas (52). En relación con los Ftalatos, la exposición ambiental se ha asociado con alteración en la función tiroidea y la homeostasis de la hormona del crecimiento (49). Algunos estudios sobre exposición a Compuestos Orgánicos Volátiles (COVs) relacionan altos niveles con complicaciones en la diabetes y la enfermedad de Parkinson, lo que podría estar relacionado con mecanismos de estrés oxidativo (52,53).

Respecto a otros compuestos, durante la pandemia, el uso de agentes antibacterianos y productos de lavado antisépticos, como aquellos que contienen triclosán (TCS), se incrementó considerablemente para controlar y prevenir la propagación de virus altamente contagiosos. Sin embargo, el uso excesivo y la eliminación de estos desinfectantes han generado preocupación debido a sus efectos adversos sobre el medio ambiente y la salud humana (54). Diversas revisiones han analizado la presencia, exposición y toxicidad del TCS, aportando información importante sobre cómo afecta a los seres humanos (40). No obstante, aún queda por resumir adecuadamente cómo evoluciona su toxicidad durante la transformación medioambiental y el metabolismo humano, ya que estos procesos pueden inducir efectos más perjudiciales para la salud.

Todo este escenario deriva hacia la tendencia de promover investigaciones que apunten a la necesidad de caracterizar el exposoma, lo que requiere más estudios de biomonitorización humana que incluyan fármacos de uso veterinario y productos de cuidado personal, así como evaluar la implementación de estudios multianalitos dirigidos a grupos de químicos potencialmente tóxicos (55).

Biomarcadores de exposición

En toxicología, un biomarcador es una característica biológica que se puede medir de manera objetiva y utilizada como un indicador de procesos biológicos normales, procesos patogénicos o respuestas farmacológicas a una intervención terapéutica (1). De este modo, son herramientas cruciales para la evaluación de la exposición a agentes químicos, la susceptibilidad a sus efectos, y la presencia de efectos tóxicos en el organismo. Por lo general, los biomarcadores se dividen en tres categorías principales: de exposición, de susceptibilidad y de efecto (56). Esta investigación aborda a los primeros, específicamente los relacionados con la exposición no ocupacional a contaminantes ambientales.

En este orden de ideas, los biomarcadores de exposición se definen como los indicadores de la presencia y cantidad de un agente químico o sus productos de transformación en el organismo. Estos biomarcadores reflejan la dosis interna del tóxico y pueden medirse en matrices biológicas como sangre, orina, cabello o tejido adiposo. Son esenciales para evaluar la cantidad de un xenobiótico a la que una persona ha estado expuesta, así como el tiempo o cronicidad de la exposición (26). El uso de biomarcadores de exposición es crucial para comprender la relación dosis-respuesta en toxicología, lo que permite estimar el riesgo asociado a la exposición a sustancias tóxicas y desarrollar políticas de salud pública para la protección de las poblaciones expuestas.

En la tabla 2 se muestran biomarcadores de exposición medidos en diferentes fluidos corporales y en diferentes poblaciones. Para compuestos como las dioxinas, los bifenilos policlorados (PCB) similares a las dioxinas entre otros, que son estables en el cuerpo humano, se mide la concentración del compuesto original en sangre, suero u orina (30, 50). En el caso de sustancias que son metabolizadas, como los pesticidas organofosforados o los ftalatos, se suelen utilizar los metabolitos del compuesto original, los cuales generalmente se miden en la orina (55, 57-59).

Por su parte, la Unión Europea ha publicado una base de datos específica para biomarcadores de exposición a factores de riesgo ambiental, conocida como ExposomeExplorer (http://exposome-explorer.iarc.fr) , que proporciona detalles sobre el tipo de biomarcadores, sus concentraciones en muestras humanas, las técnicas analíticas aplicadas para su detección, las poblaciones en las que se han medido y las correlaciones con las mediciones de exposición externa (60). Mas recientemente, ha surgido el término volatolómica, como un enfoque esencial dentro del campo de la metabolómica. La volatolómica se centra en el estudio de los metabolitos volátiles, que son productos finales del metabolismo, y permite una comprensión integral de las emisiones volátiles tanto en microorganismos como en organismos superiores, incluyendo insectos, plantas y humanos. Dado que el metaboloma humano es influenciado por factores ambientales, dietéticos y de estilo de vida, el estudio de estos compuestos volátiles ofrece un enfoque prometedor para la detección y el monitoreo de la exposición a contaminantes ambientales. Además, las recientes innovaciones en sistemas analíticos miniaturizados y portátiles abren la posibilidad de realizar investigaciones en esta área en tiempo real y en vivo, ampliando el horizonte para aplicaciones futuras en análisis químicos de campo (6163).

Estudios más recientes evalúan la posibilidad de utilizar los patrones epigenómicos, como metilaciones en el ADN, para detectar la exposición a contaminantes ambientales, sobre todo durante el embarazo y la infancia temprana, sin embargo, aún son necesarias muchas investigaciones para determinar su especificidad y desarrollar algoritmos predictivos y puntuaciones de metilación que puedan utilizarse para evaluar los factores de riesgo de los primeros años en relación con los resultados de salud a lo largo de toda la vida (64).

Matrices, preparación de la muestra y métodos analíticos Existe gran variedad de muestras biológicas que pueden ser utilizadas para determinar biomarcadores de exposición a contaminantes ambientales, las principales diferencias y los criterios para su selección están relacionadas con la ventana de detección (65). En análisis clínicos, las muestras más utilizadas tradicionalmente son el suero y el plasma, ya que la sangre completa requiere más pasos de manipulación y procedimientos de laboratorio que consumen más tiempo. Esta muestra es especialmente útil porque la detección de compuestos tóxicos indica con mayor precisión una exposición reciente, además, existe una correlación significativa entre los niveles de químicos en sangre y sus efectos en el cuerpo, por lo que es ideal para análisis cuantitativos (66,67). Una alternativa para el manejo de esta matriz ha sido el uso de muestras de sangre seca (DBS, por sus siglas en inglés), para medir marcadores no específicos de respuesta biológica interna a exposiciones ambientales usando HPLCMS; la medición de biomarcadores en DBS trae consigo ventajas sobre la punción venosa y tienden a mostrar altas correlaciones con análisis de muchos biomarcadores de exposición, incluidos cotinina, plomo, mercurio total, metilmercurio y otras sustancias químicas consideradas disruptores endocrinos (EDC) (17).

Por otro lado, la orina se usa comúnmente para investigar metabolitos, aunque un pequeño porcentaje del tóxico se excreta sin cambios; la orina es fácil de recolectar, no invasiva, está disponible en grandes cantidades y presenta menos interferencias en comparación con otras muestras. Además, tiene una gran estabilidad cuando se congela, lo que permite su almacenamiento a largo plazo. Sin embargo, la orina es una muestra susceptible a manipulaciones, ya que se recolecta sin supervisión por razones de privacidad. En relación con la ventana de aparición del tóxico o metabolito, la mayoría de los compuestos permanecen en la orina entre 2 y 5 días después de su consumo. Su uso es especialmente adecuado para ensayos inmunoenzimáticos, que permiten un análisis rápido tanto de compuestos como de metabolitos. Los niveles urinarios de estas moléculas indican exposición a las sustancias, pero no permiten determinar el momento exacto de la exposición ni los efectos fisiológicos probables (65).

El cabello también ha sido utilizado en la detección de biomarcadores de exposición (68,69); compuesto principalmente por queratina, agua, lípidos y minerales, presenta una tasa de crecimiento de entre 0.6 y 1.4 cm al mes, su recolección es no invasiva, facilitada por un simple corte, y ofrece una ventana de detección más amplia (semanas a años) en comparación con sangre u orina. Sin embargo, existen limitaciones, como la falta de correlación directa con las concentraciones sanguíneas y la posibilidad de detectar sustancias por exposición pasiva (57,69).

Por su parte, la saliva ha ganado relevancia debido a avances en los métodos analíticos y su facilidad de recolección no invasiva. Este fluido refleja la fracción libre y activa de las sustancias en la sangre, con una ventana de detección de 24 a 36 horas. No obstante, la obtención de muestras suficientes puede ser difícil y existe el riesgo de falsos positivos por exposición residual en la cavidad oral tras la inhalación de sustancias (70).

En cuanto a la exposición a sustancias durante el embarazo, la placenta y el meconio son matrices comunes; la primera, recolectada de forma no invasiva tras el parto, sirve como depósito de drogas, mientras que el meconio, excretado por el recién nacido, refleja la exposición a sustancias durante el último trimestre de gestación. Pese a sus ventajas, el meconio puede contaminarse con orina del recién nacido o perderse durante su excreción intrauterina (71).

Igualmente se ha utilizado el sebo de glándulas sebáceas para la determinación de compuestos orgánicos volátiles, que podrían estar relacionados con diabetes y la enfermedad de Parkinson. Zhang y cols. (53), utilizaron desorción térmica-cromatografía de gasesespectrometría de masas, para analizar las muestras que fueron tomadas con hisopos de poliester-rayón y algodón. Se identificaron 23 y 18 COVs en el sebo recolectado, con 14 COVs comunes a ambos tipos de hisopos, lo que resalta la potencial interferencia de los materiales o implementos para la recolección en la toma de las muestras (53).

Una matriz poco frecuente, pero que ha sido utilizada para evidenciar la exposición a contaminantes ambientales son los dientes deciduos. El análisis desarrollado por Palmer y cols. (72), comenzó con la pulverización de la muestra, la extracción con solventes orgánicos, la adición de un estándar interno y el análisis en un sistema de Cromatografía líquida acoplada a la espectrometría de masas por ionización por electrospray (LC-ESI-MS). Con esta técnica fue posible detectar sustancias químicas orgánicas semivolátiles (SVOC) específicas en dientes deciduos de niños con trastornos del espectro autista (TEA). Las tasas de detección de estas SVOC fueron similares en dos muestras diferentes de niños con TEA, una de Estados Unidos y otra de México y además, la exposición declarada por las madres se correspondía con las concentraciones de estas sustancias químicas detectadas en los dientes de sus hijos (72).

Las distintas matrices utilizadas para analizar metabolitos o compuestos, así como el tratamiento de la muestra se presentan en la tabla  2.

La elección de la matriz más adecuada también implica considerar la practicidad. Los contaminantes orgánicos persistentes son lo suficientemente estables para acumularse en tejidos ricos en lípidos y en sangre, lo que hace que la leche materna y el suero sean matrices adecuadas para estos compuestos (89). Sin embargo, la naturaleza invasiva del muestreo de sangre limita a veces su aplicabilidad, lo que ha llevado a investigar matrices alternativas como uñas o cabello, aun así, el uso de matrices no invasivas podría entrar en conflicto con los criterios de especificidad y sensibilidad biológica, y por tanto no cumplir con los requisitos de adecuación para combinaciones de biomonitoreo ambiental y biológico (EB/M). Los químicos no persistentes, o sus metabolitos, se excretan rápidamente, lo que hace de la orina una matriz más adecuada. Los metabolitos en orina típicamente reflejan la exposición reciente, lo cual podría ser engañoso en casos de exposición intermitente. Además, las tasas de excreción varían según los grupos demográficos y el peso corporal, y las concentraciones de sustancias químicas en la orina se ven afectadas por el estado de hidratación (90). Por lo tanto, estas concentraciones suelen corregirse por el contenido de creatinina o la gravedad específica (89). Como la excreción de creatinina en los niños aumenta con la edad, la corrección por creatinina podría introducir un sesgo en el análisis de los datos de las muestras de orina de los niños, haciendo que la gravedad específica sea un factor de corrección más robusto y adecuado para este grupo etario (91).

En el análisis químico toxicológico, la preparación de la muestra es un paso fundamental para asegurar que el material recolectado sea adecuado para la evaluación precisa del analito de interés. Esta preparación implica convertir la muestra, que comúnmente se presenta como una mezcla del analito, interferentes y una matriz, en un formato óptimo para su análisis. Este proceso, conocido como preparación de la muestra, busca modificar el material con el fin de facilitar un análisis químico detallado o mejorado. Aunque a menudo es tedioso y requiere de trabajo manual intensivo, tiene un impacto significativo en el tiempo total del análisis y en la calidad de los datos obtenidos. Las técnicas de preparación, como la precipitación, digestión o preconcentración, son esenciales y se seleccionan según el tipo específico de muestra y analito. En ocasiones, el éxito del método analítico depende de la correcta integración de estas técnicas o de la derivatización, un proceso que convierte el analito en un formato con funcionalidad detectable por el instrumento utilizado (92).

Los principales métodos se presentan en la tabla 3.

Es así como, el foco de muchas investigaciones está puesto en el desarrollo de métodos de pretratamiento más fáciles, con menos pasos y en ocasiones, acoplados a los sistemas de separación, siempre considerando las propiedades fisicoquímicas de los analitos, las cuales condicionan el desarrollo de metodologías relativamente completas que permitan la extracción, enriquecimiento/purificación y separación de un amplio rango de grupos de compuestos desde matrices biológicas complejas (47, 76).

Baduel y cols. (96), aplicaron un método de extracción QuEChERS modificado que les permitió el análisis simultáneo de una amplia gama de sustancias químicas (pesticidas, bifenilos policlorados, polibromados, Hidrocarburos aromáticos policíclicos, entre otros), en leche materna. Las modificaciones propuestas se relacionaron con los materiales utilizados en los métodos de extracción, con adsorbentes a base de dióxido de circonio para compuestos no polares y semipolares, y cartuchos filtrantes de eliminación de proteínas y lípidos para compuestos polares; los extractos fueron analizados mediante GC-MS/MS y Cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem con tiempo de vuelo cuadrupolar (LC-QTOFMS/MS)para cubrir una amplia gama de compuestos, concluyendo que el método desarrollado no sólo era adecuado para el análisis multiobjetivo, sino también para el cribado no dirigido (97). También se aplicó esta metodología en la medición de biomarcadores urinarios de exposición a pesticidas organofosforados, con un tratamiento previo de hidrólisis enzimática, extracción líquido-líquido y luego de la extracción QuEChERS, se inyectaron los extractos en un sistema de cromatografía líquida UHPLC acoplado a masas de alta resolución en modo de ionización por electrospray (58). 

Por otro lado, Zhu y cols. (97), desarrollaron un método de biomonitoreo que utilizó la extracción en fase sólida (SPE) acoplada a la cromatografía líquida con espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) para medir simultáneamente 121 sustancias químicas ambientales, incluyendo plastificantes, fenoles ambientales y pesticidas en muestras de orina tratadas con β-glucuronidasa/arylsulfatasa para optimizar la deconjugación, y posterior extracción LL y SPE (94). También se ha utilizado la derivatización como pretratamiento de muestras de orina, sobre todo en casos en los que se requiere implementar cromatografía de gases acoplada a masas. Tal es el caso de la detección de PFAS, en los que la baja volatilidad del compuesto, debido a su carácter polar, Baduel y cols. (96), aplicaron un método de extracción QuEChERS modificado que les permitió el análisis simultáneo de una amplia gama de sustancias químicas (pesticidas, bifenilos policlorados, polibromados, Hidrocarburos aromáticos policíclicos, entre otros), en leche materna. Las modificaciones propuestas se relacionaron con los materiales utilizados en los métodos de extracción, con adsorbentes a base de dióxido de circonio para compuestos no polares y semipolares, y cartuchos filtrantes de eliminación de proteínas y lípidos para compuestos polares; los extractos fueron analizados mediante GC-MS/MS y Cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem con tiempo de vuelo cuadrupolar (LC-QTOFMS/MS)para cubrir una amplia gama de compuestos, concluyendo que el método desarrollado no sólo era adecuado para el análisis multiobjetivo, sino también para el cribado no dirigido (97). También se aplicó esta metodología en la medición de biomarcadores urinarios de exposición a pesticidas organofosforados, con un tratamiento previo de hidrólisis enzimática, extracción líquido-líquido y luego de la extracción QuEChERS, se inyectaron los extractos en un sistema de cromatografía líquida UHPLC acoplado a masas de alta resolución en modo de ionización por electrospray (58). 

Por otro lado, Zhu y cols. (97), desarrollaron un método de biomonitoreo que utilizó la extracción en fase sólida (SPE) acoplada a la cromatografía líquida con espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) para medir simultáneamente 121 sustancias químicas ambientales, incluyendo plastificantes, fenoles ambientales y pesticidas en muestras de orina tratadas con β-glucuronidasa/arylsulfatasa para optimizar la deconjugación, y posterior extracción LL y SPE (94). También se ha utilizado la derivatización como pretratamiento de muestras de orina, sobre todo en casos en los que se requiere implementar cromatografía de gases acoplada a masas. Tal es el caso de la detección de PFAS, en los que la baja volatilidad del compuesto, debido a su carácter polar, hace que sea difícil extraerlo de la matriz, entonces al derivatizar con un compuesto particulado, la LC-MS es el método preferido para su detección debido a su alta sensibilidad y selectividad menos polar, (ésteres o radicales alquilo), se convierte el grupo carboxilo en menos polar, facilitando la extracción del metabolito de interés (98)

Métodos cromatográficos

Los recientes avances en los métodos cromatográficos han mejorado considerablemente la biomonitorización de los contaminantes ambientales. La cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS) se ha convertido en la técnica más utilizada para analizar biomarcadores de plaguicidas en diversas matrices biológicas, como la sangre, la orina y la leche materna (58). Para medir la exposición a material (73). La cromatografía de gases con detección por captura de electrones (GC-ECD) se ha utilizado para analizar la exposición no ocupacional a pesticidas (59). Además, se ha desarrollado la LC-tándem MS precedida de un método QuEChERS para detectar metabolitos de nicotina en cabello y uñas de personas expuestas al humo del tabaco (12). Aunque estas técnicas avanzadas ofrecen capacidades analíticas superiores, su elevado costo sigue siendo un factor limitante para su adopción generalizada.

En el caso de la volatolómica, la GC-MS es la técnica analítica tradicional más utilizada y se considera el método de elección en el análisis químico de compuestos volátiles (COVs) y semi-covs, combinando características que permiten la identificación cualitativa y la cuantificación de componentes a nivel de trazas a partir de matrices de muestras complejas (63).

Un aspecto innovador relacionado con la ecotoxicología lo representan los análisis no dirigidos, que son un enfoque en cromatografía y otras técnicas analíticas donde se intenta identificar y cuantificar tantos compuestos como sea posible en una muestra, sin tener una lista previa de sustancias objetivo. En este sentido, la evolución de la espectrometría de masas de alta resolución y precisión de masa ha impulsado esta tendencia; sin embargo, para mantener el ritmo de esta evolución en las estrategias analíticas, se necesitan metodologías de preparación de muestras genéricas que ofrezcan un análisis rápido y confiable de un gran número de compuestos (99).

En relación con esto, Li y col (77), utilizaron un enfoque metabolómico no dirigido utilizando cromatografía de gases y líquidos acoplada a espectrometría de masas (GC-MS y LC-MS) para analizar metabolitos urinarios en 92 participantes jóvenes y saludables expuestos a ambientes con material particulado (PM), e identificaron 155 metabolitos diferenciales asociados con la exposición a bioaerosoles, incluyendo aminoácidos, ácidos grasos y nucleótidos, entre los metabolitos identificados, la 16-dehidroprogesterona y el 4-hidroxifeniletanol fueron destacados como posibles biomarcadores urinarios para predecir o diagnosticar enfermedades relacionadas con la exposición a PM o bioaerosoles (77).

Por su parte, Geer y cols. (34), aplicaron una metodología de análisis dirigido y no dirigido en muestras de aire exhalado en personas expuestas a incendios, mediante desorción térmica automatizada-GC/MS (ATD-GC/ MS) en modo de monitoreo de iones seleccionados (SIM)/escaneo, y se revisaron en busca de químicos prominentes. Los compuestos dirigidos incluían productos de la combustión, como benceno, tolueno, xileno e hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAH), que sirven como evaluación estándar de la exposición. Se identificaron sesenta características químicas únicas representativas de químicos exógenos y compuestos endógenos, incluyendo aromáticos de anillo simple, hidrocarburos aromáticos polinucleares, compuestos volátiles que contienen azufre, aldehídos, alcanos y alquenos utilizando el flujo de trabajo de análisis no dirigido. 

Los datos demuestran que hay compuestos no dirigidos que son indicativos de exposición ambiental (34). En esta matriz también se han determinado metabolitos para evaluar la exposición a percloroetileno (86) y metabolitos del benzopireno (87).

Sin duda, ambas técnicas, la cromatografía líquida (HPLC) y la cromatografía de gases (GC) ofrecen ventajas y limitaciones distintas en el análisis químicotoxicológico. Mientras que la HPLC es ideal para compuestos que no son volátiles o que se descomponen a altas temperaturas, la GC es preferida para analizar compuestos volátiles y térmicamente estables. La HPLC permite el análisis de una amplia gama de sustancias, incluyendo compuestos polares y de alto peso molecular, sin necesidad de derivatización, lo cual simplifica la preparación de la muestra. Sin embargo, la GC suele ofrecer una mejor resolución y tiempos de análisis más cortos, además de ser más eficiente en términos de separación cuando se trabaja con compuestos volátiles. A pesar de sus diferencias, la combinación de ambas técnicas con un detector de masas ha marcado un hito revolucionario en el análisis toxicológico, brindando una capacidad sin precedentes para identificar y cuantificar trazas de sustancias tóxicas con gran precisión y sensibilidad. Los límites de detección y cuantificación se han mejorado significativamente gracias al uso de la espectrometría de masas, permitiendo la identificación de compuestos presentes en concentraciones muy bajas y proporcionando resultados confiables, fundamentales para el estudio de biomarcadores de interés toxicológico (99).

Conclusiones

La identificación de biomarcadores para la exposición a contaminantes ambientales es un desafío cambiante, en la misma medida en la que surgen nuevos productos y tecnologías. Una comprensión más profunda de los perfiles metabólicos de los compuestos involucrados constituye una herramienta fundamental para identificar las sustancias más apropiadas como biomarcadores de exposición. Si bien los avances en las técnicas cromatográficas han permitido detectar y cuantificar con mayor precisión un amplio rango de contaminantes en diferentes matrices biológicas, aún existen limitaciones en la capacidad de diferenciar entre fuentes de exposición y la correlación precisa con respuestas dosis-dependientes.

El uso de matrices biológicas como sangre, orina, saliva y cabello ha demostrado ser útil, pero se requiere una mayor investigación para optimizar la recolección y preparación de estas muestras, especialmente en lo que respecta a la eliminación de interferencias y la mejora en la reproducibilidad de los resultados. La necesidad de métodos más sostenibles y automatizados en la preparación de muestras, así como la implementación de tecnologías más sensibles como la espectrometría de masas de alta resolución, será crucial para el futuro del análisis cromatográfico. La integración de estas tecnologías con enfoques como la metabolómica tiene el potencial de identificar biomarcadores más precisos y específicos, que no solo permitan monitorear la exposición a contaminantes ambientales de forma más eficaz, sino también evaluar los efectos a largo plazo en la salud humana. En este sentido, el futuro de la biomonitorización se orienta hacia una combinación de métodos cromatográficos avanzados y una comprensión más profunda del exposoma humano. Este enfoque amplio no solo permitirá una mejor comprensión de la exposición a contaminantes ambientales en diversas formas, sino que también facilitará el desarrollo de metodologías analíticas más precisas y eficaces para el monitoreo de la exposición humana a través de distintos biomarcadores y matrices biológicas.

Referencias

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