Acta Científica de la Sociedad Venezolana de Bioanalistas Especialistas

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Cuantificación de los niveles de carga viral de SARS-CoV-2 por PCR en tiempo real en individuos referidos al instituto nacional de higiene “Rafael Rangel”

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  1. Bioanalista, Centro Clínico de Maternidad Leopoldo Aguerrevere
  2. Docente Instructor Cátedra de Parasitología, Universidad Central de Venezuela
  3. Jefe Departamento de Virología-Dirección de Diagnóstico y Enfermedades Transmisibles-Instituto Nacional de Higiene “Rafael Rangel”
  4. Docente Asistente Cátedra de Virología, Universidad Central de Venezuela.Premio SVBE XVII Congreso Venezolano de Bioanalisis 2023

Autor para la correspondencia: Valerie Ross — [email protected]

DOI: 10.71034/SVBE.2023.26.2.01 Recibido: 22/07/2023 Aceptado: 15/09/2023

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Cuantificación de los niveles de carga viral de SARS-CoV-2 por PCR en tiempo real en individuos referidos al instituto nacional de higiene “Rafael Rangel”

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Cuantificación de los niveles de carga viral de SARS-CoV-2 por PCR en tiempo real en individuos referidos al instituto nacional de higiene “Rafael Rangel”

Introducción: COVID-19, infección viral altamente transmisible y patógena causada por el SARS-CoV-2, surgió en China y se extendió por el mundo creando una pandemia. Se ha demostrado que la dinámica viral tiene influencia en el progreso de la enfermedad. Es importante contar con herramientas que permitan evaluar su curso. Por ello, se propone estandarizar la técnica de qRT-PCR para la cuantificación de los niveles de carga viral del SARS-CoV-2. Objetivo: Estandarizar la técnica de qRT-PCR para la cuantificación de los niveles de carga viral del SARS-CoV-2 en pacientes referidos al Instituto Nacional de Higiene “Rafael Rangel” (INHRR). Metodología: Se realizó una curva de calibración a partir de un estándar del gen E del SARS-CoV-2 con 108 copias virales/μL, se realizaron diluciones seriadas 1:10 y se establecieron 8 puntos para obtener la función lineal necesaria mediante los métodos estadísticos adecuados. Se cuantificó la carga viral de 230 muestras provenientes del tracto respiratorio superior mediante qRT-PCR, extraídas previamente con el método de perlas magnéticas y/o columnas de sílica gel. Resultados: Se obtuvo una curva estándar de calibración con un coeficiente de correlación (r2) de 0,9959 y Eficiencia (E) de 79%. Se correlacionó el Ct obtenido de las muestras con el número de copias virales presentes en ellas, obteniéndose un promedio de carga viral que oscila en el orden de 104 copias virales/μL en sintomáticos y 103 copias virales/μL en asintomáticos. Conclusión: Este trabajo representa el primer reporte de estandarización de una metodología para la cuantificación de los niveles de carga viral del SARS-CoV-2 en muestras del tracto respiratorio superior en Venezuela, para la implementación y uso de una herramienta útil en el monitoreo de los casos de COVID-19. Se observó que los niveles de carga viral en las muestras de estudio presentaban un promedio de carga viral que oscila en el orden de 103 - 104 copias virales/μL.

Palabras clave: carga viral, SARS-CoV-2, COVID-19, qRT-PCR.

Quantification Of SARS-COV-2 Viral Load Levels By Time-Time Pcr Real In Individuals Referred To The National Institute Of Hygiene “Rafael Rangel”

Introduction: COVID-19, a highly transmissible and pathogenic viral infection caused by SARS-CoV-2, emerged in China and spread worldwide, creating a pandemic. Viral dynamics have been shown to influence disease progression. It is important to have tools to evaluate its course. Therefore, it is proposed to standardize the qRT-PCR technique for the quantification of SARS-CoV-2 viral load levels. Objective: To standardize the qRT-PCR technique for the quantification of SARS-CoV-2 viral load levels in patients referred to the INHRR. Methodology: A calibration curve was generated from a SARS-CoV-2 gene E standard with 108 viral copies/μL, serial 1:10 dilutions were performed, and 8 points were established to obtain the necessary linear function using appropriate statistical methods. The viral load of 230 upper respiratory tract samples was quantified by qRT-PCR, previously extracted with the magnetic bead and/or silica gel column methods. Results: A standard calibration curve with r2 of 0.9959 and Efficiency of 79% was obtained. The Ct obtained from the samples was correlated with the number of viral copies present in them, obtaining an average viral load that ranges in the order of 104 viral copies/μL in symptomatic patients and 103 viral copies/μL in asymptomatic patients. Conclusion: This work represents the first report of the standardization of a methodology for the quantification of SARS-CoV-2 viral load levels in upper respiratory tract samples in Venezuela, for the implementation and use of a useful tool in the monitoring of COVID-19 cases. It was observed that the viral load levels in the study samples presented an average viral load that ranges in the order of 103 - 104 viral copies/μL.

Keywords: viral load, SARS-CoV-2, COVID-19, qRT-PCR.

Introducción

La COVID-19 es una infección viral altamente transmisible y patógena causada por el Coronavirus del Síndrome Respiratorio Agudo Severo 2 (SARS-CoV-2), que surgió en Wuhan, China y se extendió por todo el mundo (1). El agente infeccioso fue identificado el 7 de enero de 2020 como un nuevo Coronavirus y se denominó provisionalmente 2019-nCoV, que se cree que se originó en el mercado de mariscos de Huanan (2,3). Debido a su marcada similitud en términos de síntomas clínicos y naturaleza biológica con el agente causante del Síndrome Respiratorio Agudo Severo, el SARS-CoV, el nuevo coronavirus fue nombrado SARS-CoV-2 por el Comité Internacional de Taxonomía de Virus (ICTV) (2,4). El virus se informó por primera vez en diciembre de 2019 y la Organización Mundial de la Salud (OMS) la clasificó como pandemia el 11 de marzo de 2020 (5).

Tan pronto como se identificó el patógeno causal y se determinó su secuencia genómica, se estableció rápidamente un diagnóstico de laboratorio basado en tecnologías de amplificación de ácidos nucleicos, lo cual ha permitido un abordaje clínico oportuno. Se necesitan con urgencia estrategias que puedan detectar eficazmente la progresión de la enfermedad para estratificar a los pacientes para una atención adecuada y que, por lo tanto, puedan prevenir la exacerbación de la enfermedad (6).

Los Coronavirus (CoV) son un grupo de virus envueltos con genomas de ARN no segmentados, monocatenarios y de sentido positivo. Además de infectar una variedad de vertebrados importantes, pudiendo afectar el sistema nervioso central, hepático, gastrointestinal y respiratorio de vacas, aves, murciélagos, ratones y muchos otros animales salvajes. El SARS-CoV-2 es un virus nuevo perteneciente a la subfamilia Orthocoronavirinae género Betacoronavirus y al subgénero Sarbecovirus y dentro de ellos al linaje 2. Infecta y se replica de forma eficiente en los neumocitos, macrófagos y células dendríticas de las partes más profundas del parénquima pulmonar en las que reside el receptor celular ACE2 (Enzima Convertidora de Angiotensina II, por sus siglas en inglés) que es utilizado por este virus para unirse a dichas células e iniciar el proceso infeccioso (4,7).

La secuencia de SARS-CoV-2 compartida en la plataforma GISAID (Iniciativa Mundial para Compartir Datos sobre la Influenza Aviar, por sus siglas en inglés), permitió el desarrollo de varias pruebas de diagnóstico molecular a través del diseño de cebadores y sondas específicas para la detección rápida mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa con transcriptasa reversa en tiempo real (qRT-PCR) (8,9).

A lo largo del curso pandémico se ha demostrado que la dinámica viral tiene influencia en la evolución de la enfermedad, asociada a la sintomatología que presentan los pacientes infectados por el SARS-CoV-2. Es de suma importancia contar con herramientas que permitan evaluar el curso y progreso de la enfermedad. Por ello, se propone estandarizar la técnica de qRT-PCR para la cuantificación de los niveles de carga viral del SARS-CoV-2 en pacientes referidos al Instituto Nacional de Higiene “Rafael Rangel”, con la finalidad de correlacionar los valores de copias virales con el valor umbral o Ct obtenido. Estos valores serán de utilidad para poder investigar a futuro la dinámica de la infección viral en los pacientes sintomáticos y asintomáticos, así como evaluar el comportamiento de las variantes emergentes, resistencia a medicamentos, cuasiespecies y fitness vitral, entre otros. (10,11).

Materiales y métodos

Tipo y toma de muestras

Las muestras del tracto respiratorio superior corresponden al tipo de muestra empleado en este Trabajo Especial de Investigación (230 muestras), debido a que en el epitelio respiratorio superior el virus tiene una tasa de replicación importante y es de fácil obtención. Dentro de estas muestras se incluyen hisopado nasofaríngeo, orofaríngeo y nasal (12).

Preparación de la muestra

Todas las muestras se consideran potencialmente infecciosas. Es recomendable que se incuben a 56 °C en un termobloque durante 30 minutos para inactivarlas antes de la extracción de ácidos nucleicos con la finalidad de asegurar una pérdida total de la infectividad mientras se conserva la integridad de los ácidos nucleicos (13). Posterior a esto, se procede a extraer los hisopos contenidos en el medio de transporte viral que se utilizaron para la obtención de la muestra, luego de someterse a un paso de centrifugado de ser necesario (si la muestra es muy viscosa) y mezclado con vortex.

Extracción de ácidos nucleicos

Para la extracción de ácidos nucleicos se emplearon dos metodologías diferentes de acuerdo a la disponibilidad de reactivos y consumibles, las cuales son: método de extracción manual por adsorción en columnas de sílica gel y método automatizado por separación con perlas magnéticas con la utilización del equipo MGISP-960. 

Detección y amplificación del gen E mediante técnicas de RT-PCR en tiempo real

Para la amplificación del material genómico de cada muestra se siguen las instrucciones del protocolo desarrollado por el Instituto de Virología Charité – Universitätsmedizin Berlín en Alemania, utilizando cebadores altamente conservados de la región genómica de la envoltura E del SARS-CoV-2 (14). Cada ensayo de PCR es llevado a cabo en un volumen final de 25 mL, en presencia de Buffer 10X, los cebadores y la sonda FAM (ver Tabla 1); 5 U/mL de la enzima One Step transcriptasa reversa CWBIO. En cuanto al volumen de muestra o controles, se utilizan 5 mL de extracto de ARN.

Diseño de una curva estándar de calibración para la cuantificación de los niveles de carga viral de SARS-CoV-2

Para la cuantificación de los niveles de carga viral, se requiere realizar una curva estándar de calibración a partir de un control positivo (estándar) del gen E del SARS-CoV-2 con un número conocido de copias virales. Dicho control contiene 108 copias, a partir del cual se harán diluciones seriadas 1:10 del mismo y se establecerán al menos 8 puntos para obtener la función lineal necesaria para construir la curva de calibración mediante el uso del método de los “mínimos cuadrados” con la finalidad de que se tenga exactitud y confiabilidad estadística al obtener los parámetros para la función de la curva de calibración.

Validación de los resultados

Para la validación de cada placa de reacción se incluyeron controles tanto positivo (PTC) como negativo (NTC), así como una dilución del estándar SARS-CoV-2 iv-RNA E-gene de 108 copias liofilizado, correspondiente a un punto de la curva de calibración realizada, y un control del agua libre de nucleasas empleada en la extracción de los ácidos nucleicos, para la obtención de resultados validados adecuadamente.

Por otra parte, de manera de poder validar y controlar el procedimiento de extracción de ácidos nucleicos, para demostrar la recuperación exitosa del ARN del SARS-CoV-2 de las células del epitelio respiratorio, así como la integridad del reactivo de extracción, se realiza la identificación mediante qRT-PCR del gen de RNasa P (RP) humana. Esto se realiza para cada muestra ensayada en otra placa de reacción diferente, ya que el kit empleado utiliza la misma sonda que para la detección del gen E (sonda FAM).

Tabla 1. Cebadores y sonda empleados para la qRT-PCR para la detección del gen E

Tabla 1. Cebadores y sonda empleados para la qRT-PCR para la detección del gen E

FAM: 6-carboxifluoresceína; BBQ: blackberry quencher (67).

Resultados

Curva estándar de calibración (Número de copias virales/mL vs Ct):

En la Tabla 2, se pueden observar los valores de Ct obtenidos para cada punto de la curva de calibración; así mismo, los valores de cada una de las réplicas de los puntos de dilución establecidos 1:10.

Tabla 2. Valores de Ct para la obtención de la curva estándar de calibración

Tabla 2. Valores de Ct para la obtención de la curva estándar de calibración

Como se puede observar en los resultados obtenidos, aquellas diluciones que presentan mayor número de copias virales arrojan valores de Ct más bajos, por lo que se establece una relación inversamente proporcional en la que a menor valor de Ct, se estiman valores de carga viral elevados.

En líneas generales, en cada réplica de las diluciones del estándar de calibración hubo buena reproducibilidad y baja dispersión entre ellas, demostrando que para las diluciones 107 y 108, todas las réplicas se encontraron dentro del rango ±1DS, mientras que para las diluciones 106 y 105, solo una réplica de cada uno de ellos se alejó muy ligeramente de dicho rango. En las diluciones 103 y 104 una réplica de cada dilución se encontró muy alejada de la primera desviación estándar para cada grupo de réplicas, por lo que se excluyeron del estudio.

A continuación, en la Figura 1, se pueden contemplar las curvas de amplificación obtenidas y sus diluciones respectivas.

Figura 1. Curvas de amplificación de las diluciones seriadas correspondientes a la curva estándar de calibración.

Figura 1. Curvas de amplificación de las diluciones seriadas correspondientes a la curva estándar de calibración.

Para la construcción de la curva de calibración, fueron tomados en consideración la media de los valores de Ct obtenidos de las tres réplicas para cada dilución, exceptuando una de las réplicas para la dilución 104 y 103, respectivamente. En el Gráfico 1, se puede detallar la curva estándar de calibración obtenida.

Gráfico 1. Curva estándar de calibración: Log[Carga viral] (Log[Número de copias virales/mL]) vs Ciclo umbral (Ct):

Gráfico 1. Curva estándar de calibración: Log[Carga viral] (Log[Número de copias virales/L]) vs Ciclo umbral (Ct):

un 100% de positividad para la detección del gen E del SARS-CoV-2.

En el gráfico se detalla la función de la recta con sus respectivos valores de pendiente (m) de -3,9714 y punto de corte en el eje “y” (b) de 46,371, así como el valor de coeficiente de correlación lineal (r2) de 0,9959, lo cual es indicativo de la calidad de la curva para replicar los resultados. La eficiencia (E) de la amplificación resultó ser de 79% (15,16).

Detección y amplificación del gen E mediante técnicas de RT-PCR en tiempo real

Todas las muestras procesadas amplificaron para la detección del control interno (RNAsa P) y se encontró un 100% de positividad para la detección del gen E del SARS-CoV-2.

En relación a la sintomatología presentada, un total de 120 pacientes (52,2%) corresponde a pacientes sintomáticos; de los cuales 10 de ellos (4,3%) tuvieron una evolución de la enfermedad que culminó con su fallecimiento. Por otra parte, un total de 110 individuos (47,8%) cursaron la infección de forma asintomática. Estos datos se corresponden con los obtenidos a nivel mundial, donde se señala que la mayoría de los individuos padecen cuadros respiratorios leves y se recuperan sin tratamiento especial (17,18).

Aquellos individuos que presentaron sintomatología, fueron clasificados de acuerdo a la severidad de su padecimiento en cuatro categorías: enfermedad leve, enfermedad moderada, enfermedad grave y enfermedad crítica, como fue detallado en el marco teórico. Un total de 120 pacientes (52,2%) presentaron sintomatología, dentro de los cuales destacan 49 pacientes con enfermedad leve (21,3%), 45 pacientes con enfermedad moderada (19,6%), 16 pacientes con enfermedad grave (6,9%) y, por último, 10 pacientes con enfermedad crítica (4,4%).

Correlación de los Ct de las muestras con el número de copias virales

Para correlacionar los valores de Ct de cada una de las muestras con el número de copias virales/mL, se realizó la extrapolación de dichos valores a la curva estándar de calibración, mediante el uso de la función de la recta obtenida y = -3,9724x + 46,371 para así obtener los niveles de carga viral en estos individuos.

Estos valores se pueden evidenciar en la Tabla 3, donde se observa que se agruparon las muestras en estudio en grupos de acuerdo a sus valores de Ct obtenidos, entendiendo que la relación entre el Ct y la carga viral es inversamente proporcional.

Tabla 3. Extrapolación de valores de Ct con el número de copias virales/mL

Tabla 3. Extrapolación de valores de Ct con el número de copias virales/L

En el Gráfico 2 se demuestra una representación de los valores de carga viral obtenidos de acuerdo a la clasificación de los individuos sintomáticos, asintomáticos y fallecidos.

Gráfico 2. Rango de valores de carga viral en la muestra estudiada.

Gráfico 2. Rango de valores de carga viral en la muestra estudiada.

Como se puede observar, la mayor parte de los individuos estudiados, tanto sintomáticos, como asintomáticos, arrojaron valores de carga viral bajos, encontrándose que el rango de valores de carga viral más frecuente fue el de 2,3 x 103 – 79 copias virales/mL. Pero también es importante destacar que en el caso de los grupos de cargas virales elevadas (³ 1,3 x 107 y 6,3 x 106 - 2,5 x 105) los individuos más frecuentemente encontrados con dichos valores fueron los sintomáticos, por encima de los asintomáticos.

Se encontró que el comportamiento en líneas generales entre el grupo de pacientes sintomáticos y asintomáticos fue bastante similar. Ambos grupos mostraron valores promedios de carga viral en el orden de 104 y 103, respectivamente.

Por otra parte, los asintomáticos siguen demostrando ser un grupo de interés de estudio puesto que un 13% (14/110 individuos) presentaron también cargas virales elevadas (> 1 x 105 copias virales/mL). Estos datos se correlacionan con resultados expuestos en otros estudios en los cuales resumen la evidencia que destaca la transmisión por individuos asintomáticos y pre-sintomáticos, resaltando que la carga viral de casos asintomáticos y sintomáticos es comparable y que la excreción viral es mayor antes de la aparición de los síntomas, lo que sugiere una alta transmisibilidad antes de los síntomas (19).

En cuanto a la severidad de la enfermedad, se pudo observar que los pacientes fallecidos, que corresponden a aquellos con enfermedad crítica, reflejaron cargas virales bajas, pudiendo obedecer esto a diversos factores tales como el momento de la toma de la muestra, ya que es importante que la toma se realice en la fase aguda de la enfermedad, es decir, en el momento que existe replicación viral activa, y no como ha ocurrido en ocasiones que se realiza de forma post mortem. Además, diversos estudios han señalado que, si bien las muestras provenientes del tracto respiratorio superior son adecuadas para el diagnóstico de los pacientes infectados con el virus, en caso de pacientes críticos las muestras de elección y más idóneas son las provenientes del tracto respiratorio inferior, tales como lavado broncoalveolar, esputo y/o aspirado endotraqueal (7,19). Incluso, es de señalarse también que aquellos pacientes críticos corresponden a pacientes que han requerido hospitalización, y que probablemente hayan sido tratados con fármacos antivirales como lo es el Remdesivir, por lo que esto pudiera subestimar también los valores de carga viral obtenidos en el análisis.

Correlación de la carga viral con la severidad y/o progresión de la enfermedad

En el Gráfico 3, se evidencian los valores de carga viral que manejaron los individuos según el grado de enfermedad que desarrollaron, bien sea enfermedad leve, enfermedad moderada, enfermedad grave o enfermedad crítica.

Gráfico 3. Valores de carga viral vs. Progresión de la enfermedad.

Gráfico 3. Valores de carga viral vs. Progresión de la enfermedad.

Como se puede observar, los individuos que desarrollaron enfermedad leve (49 individuos) obtuvieron un promedio de carga viral igual a 1,0 x 104 copias virales/mL. En cuanto a aquellos que desarrollaron enfermedad moderada (45 individuos) se tiene que el promedio de carga viral obtenido fue igual a 1,3 x 104 copias virales/mL. Por otra parte, los individuos que padecieron enfermedad grave (16 individuos) tuvieron un promedio de carga viral igual a 1,8 x 104 de copias virales/mL. Por último, aquellos individuos que desarrollaron enfermedad crítica (10 individuos) obtuvieron un promedio de carga viral igual a 2,5 x 103 copias virales/mL.

El presente estudio proporciona una herramienta útil en el laboratorio de biología molecular para el seguimiento clínico del paciente, que permita evaluar progresión de la enfermedad a través de la cuantificación de la carga viral, lo que, a su vez, permita implementar terapias de acuerdo a la severidad y pronóstico de la patología en curso, pero que, además, sirva de base para futuras líneas de investigación donde se pueda correlacionar la carga viral con la transmisibilidad del virus.

Referencias

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