Biomarcadores serológicos en el Inmunodiagnóstico de la condición celíaca

Introducción

La enfermedad celíaca (EC) o también conocida como condición celíaca o celiaquía, es una enteropatía, caracterizada por una respuesta inflamatoria crónica que se desencadena en individuos genéticamente susceptibles al ingerir gluten, específicamente a una de sus proteínas constituyentes encontradas en el trigo, la cebada, el centeno y la avena, denominadas gliadina, hordeína, secalína y avenina, respectivamente (1). Su causa es multifactorial y los factores genéticos, ambientales y dietéticos tienen una significación importante en su aparición. Se ha demostrado que la EC se presenta principalmente en pacientes que están genéticamente predispuestos, es decir presentan los alelos que codifican las moléculas HLA-DQ2/DQ8 (2). La expresión de los alelos HLA-DQ2 o HLA-DQ8 está asociada a un mayor riesgo a desarrollar la EC (3, 4). La EC tiene una amplia gama de presentaciones clínicas, que van desde pacientes asintomáticos, sintomáticos típicos que cursan con alteraciones gastrointestinales como diarreas, estreñimiento, distensión abdominal, reflujos, etc; hasta individuos con sintomatología atípica como anemia, dermatitis herpetiforme, osteoporosis, abortos recurrentes, trastornos neurológicos y otros sin variaciones en el tracto digestivo. La principal complicación clínica que presentan estos pacientes es una lesión intestinal con atrofia vellositaria, hiperplasia de las criptas e infiltrado celular inflamatorio (5,6). Como consecuencia se produce la inadecuada absorción de los nutrientes con repercuciones clínicas y funcionales variables dependiendo de la edad y condición del paciente (1,7,8,9). En las últimas décadas la epidemiología de la EC ha sido replanteada. Esta enteropatía tiene una incidencia del 0,5-1% en la mayoría de los países, aumentando en algunos países europeos (5,10). La EC afecta tanto a niños como a adultos y la relación mujer/varón es de 2:1 (11) .

Estudios recientes comparan la epidemiología de la EC con un iceberg, donde solo la punta del mismo son los casos diagnosticados por su sintomatología típica, y la profundidad del iceberg es el resto de los individuos afectados que pasan inadvertidos, pues no tienen una sintomatología clara o no la poseen (12). Entre las dificultades para confirmar el diagnóstico, se mencionan: casos asintomáticos, mala praxis médica al confundir esta condición con otra patología con sintomatología similar, la gran cantidad de exámenes que se le deben realizar al paciente, entre ellos, biopsia de duodeno/yeyuno que es la prueba diagnóstica confirmatoria. Esta última, es un método invasivo que anteriormente debía ser repetido tres veces en caso de que el resultado de la primera muestra mostrara alteraciones histológicas en la mucosa intestinal compatibles con el diagnóstico de EC (12,13) .

En Venezuela la incidencia de esta condición probablemente sea similar al resto del mundo, sin embargo, los datos estadísticos posiblemente no están acorde con la realidad, debido al sub-registro que existe de los casos clínicamente diagnósticados como otras patologías. Estudios recientes sugieren una importante prevalencia de esta condición en el país, siendo necesario ampliar estas investigaciones (14). En 1990 el comité de expertos de la Sociedad Española de Gastroenterología, Hepatología y Nutrición Pediátrica (ESPGHAN, por sus siglas en ingles), propone realizar al paciente solamente una biopsia para confirmar el diagnóstico y otra al año para monitorear el progreso de la EC. Asi mismo, este comité plantea que las biopsias sólo se realizarán en caso de pacientes con un perfil serológico positivo previamente establecido (15). En 2012, la ESPGHAN en una nueva guía expone que la serología constituye una herramienta fundamental para el diagnóstico de la EC, y considera que deberían ser las primeras pruebas a realizar en pacientes con sintomatología clínica previo a la biopsia intestinal (16).

El perfil serológico incluye la determinación de anticuerpos anti-gliadina (AAG) IgA e IgG; anticuerpos anti-transglutaminasa tisular (AtTG) IgA e IgG, anticuerpos anti-endomisio (EMA), los cuales se consideran marcadores inmunológicos asociados a la EC. Actualmente, se ha demostrado que la utilidad diagnóstica de estos marcadores tienen sus limitaciones, entre estas se menciona la baja sensibilidad de los AAG de tipo IgA, que va de 75-95%, obteniéndo así, una gran cantidad de resultados falsos negativos, y los de tipo IgG con baja especifidad dando elevados falsos positivos pues se detectan también en otras patologías intestinales (17). De acuerdo a las recientes investigaciones que han evaluado la sensibilidad y especificidad de estos marcadores séricos, algunos autores proponen realizar pruebas más específicas, como la investigación de anticuerpos anti-péptidos deaminados de gliadina (anti-DPG) IgA e IgG. Investigaciones recientes han revelado que la transglutaminasa tisular (tTG) desamina los péptidos de gliadina que atraviesan el borde de la mucosa de los pacientes celíacos, lo que los convierte en mucho más inmunogénicos que los péptidos de gliadina sin procesar. Por lo tanto, los péptidos de gliadina desaminados representan blancos más específicas para los anticuerpos anti-gliadina que se producen en los pacientes celíacos. Las pruebas para determinar anti-DPG han mostrado tener una alta sensibilidad y especificidad que en conjunto con otros marcadores, como los nombrados anteriormente y podrían representar mayores ventajas para apoyar un diagnóstico presuntivo de EC; sugerir el momento que se debe realizar la biopsia intestinal y monitorear el cumplimiento de una dieta exenta de gluten (18).

El objetivo de este estudio fue evaluar la utilidad, sensibilidad y especificidad de los biomarcadores serológicos IgA-IgG anti-gliadina y los recientemente descritos anticuerpos IgA e IgG anti-DPG, como prueba diagnóstica y de seguimiento en pacientes asintomáticos y sintomáticos típicos con EC.

Materiales y Métodos

Población y muestra: se evaluaron 140 muestras de suero, las cuales fueron divididas en tres grupos : a) 84 muestras provenientes de pacientes con diagnóstico clinico de EC en edades comprendida entre 11 meses y 48 años. Estas muestras fueron evaluadas por medio de la determinación de anticuerpos IgG e IgA específicos del perfil celíaco; con estudio de alelos HLA por técnicas de Biología Molecular y mediante estudios histológicos en biopsia de duodeno/yeyuno; b) 19 muestras provenientes de familiares en primer grado de consanguinidad de los pacientes (padres, madres y hermanos). Las muestras de pacientes y familiares relacionados fueron gentilmente donadas por el Laboratorio de Fisiopatología del Centro de Medicina Experimental en el Instituto Venezolano de Investigaciones científicas (IVIC) y; c) 37 muestras obtenidas de individuos aparentemente sanos (grupo control), comparables en edad y sexo provenientes de la comunidad universitaria que asistieron voluntariamente al Laboratorio de Investigaciones Básicas y Aplicadas, Cátedra de Bioquimica, de la Escuela de Bioanálisis, Universidad Central de Venezuela. Las muestras de sangre del grupo control se tomaron por punción venosa (5 mL-7mL) del antebrazo previa asepsia, utilizando tubos vacutainer sin anticoagulante. Las muestras de sangre total permanecieron a temperatura ambiente por 30 min hasta la retracción del coagulo, se centrifugaron a 3.500 rpm, se separon los sueros en tres alicuotas y se conservaron a -20ºC hasta ser procesadas en los diferentes ensayos. A todos las muestras objeto del estudio se les realizó determinación de IgA e IgG anti-gliadina e IgA e IgG anti-DPG por ELISA. Se realizó adicionalmente la determinación de IgA total a 45 pacientes celíacos a objeto de valorar este parámetro y discutir sobre la posible asociación con una deficiencia selectiva de IgA en esta condición, como ha sido descrito por otros autores.

Determinación de anticuerpos IgA-IgG anti-gliadina: fueron determinados en pruebas separadas con el estuche comercial QUANTA Lite™ Gliadin IgG o IgA ELISA indirecto (INOVA diagnostics, Inc. United States of America) para detectar anticuerpos contra antígeno de gliadina purificado. El punto de corte (cut-off) establecido por la casa comercial fue de 20U/mL, considerando muestras positivas débil aquellas que presentaron un valor entre las 20-30 U/mL y positivas fuertes a valores mayor o igual a 30U/mL (≥30U/mL) ynegativasconresultadosmenoresa 20U/mL (≤20U/mL).

Determinación de anticuerpos IgA e IgG anti-DPG: fueron determinados en pruebas separadas por ELISA indirecto, con el estuche comercial ORG 551G Anti-DPG (ORGENTEC Diagnostika Gmbh, Mainz-Germany) para detectar anticuerpos frente a proteínas de gliadina deaminada. El punto de corte (cut-off) establecido por la casa comercial fue de 10U/mL, considerando muestras positivas aquellas que presentaron un valor mayor o igual a 10U/mL (≥10U/mL) y negativas con resultados menores a 10U/mL (≤10U/mL).

Determinación de IgA total: la determinación de IgA total se realizó por medio de la técnica de inmunodifusión radial, con un estuche comercial IgA RID (LTA s.r.l. Milano, Italy). Los valores de referencia para esta prueba son de 90-450 mg/dL.

Análisis estadístico: se determinaron los parámetros estadísticos, Media (x), mediana (Md), Moda (Mo), Error estándar (ES), Riesgo Relativo (RR) Odds Ratio (OR), valores mínimos y valores máximos, sensibilidad y especificidad diagnóstica e intervalo de confianza (CI) de 95%, con la finalidad de evaluar el comportamiento de los marcadores serológicos descritos en el grupo de pacientes y grupo control. Estos datos fueron calculados por el programa www.umbeuc.d/utilidades_ herramientas.html. Para tomar en cuenta todas las problaciones en estudio, lo cual presenta la ventaja de detectar diferencias significativas más pequeñas y de incluir la variabilidad total de universo estudiado se realizó una prueba de análisis de varianza (ANOVA) con el empleo del programa Sigma Plot estableciendo un nivel de significancia de p<0.05.

Resultados

Sensibilidad y especificidad diagnóstica del ensayo IgA anti-gliadina

En la tabla 1 se muestra que de los 84 pacientes con condición celíaca 30 (35.71%) dieron positivos para IgA anti-gliadina y 9 individuos del grupo control (24,32%) resultaron positivos para esta prueba. Se obtuvo resultados negativos en 54 (64,28%) de los pacientes y 28 (75,68%) de los controles. La sensibilidad diagnóstica del ensayo fue de 36% y la especificidad diagnóstica fue de 76%. El valor predictivo positivo y negativo obtenido fue de 77% y 34% respectivamente con un riesgo relativo de 1,47 y un CI (0,78-2,278).

Sensibilidad y especificidad diagnóstica del ensayo IgG anti-gliadina

La tabla 2 muestra que 53 (63,09%) pacientes con condición celíaca fueron positivos para IgG anti-gliadina y 9 individuos del grupo control (24,32%) resultaron positivos. Así también, 31 (36,91%) de los pacientes y 28 (75,68%) de los controles fueron negativos en esta evaluación. La sensibilidad y especificidad diagnóstica del ensayo fue de 63% y 76% respectivamente. Se obtuvo un valor predictivo positivo de 85%; un valor predictivo negativo del 47% y un riesgo relativo de 2,59 con un CI (1,44 - 4,49 ).

Sensibilidad y especificidad diagnóstica del ensayo IgA anti-DPG

En la tabla 3 se muestra que para IgA anti-DPG 15 (17,85%) pacientes y 3 (8,10%) del grupo control resultaron positivos. Asimismo, 69 (82,14%) de los pacientes y 34 (91,89%) de los controles fueron negativos para este marcador. De esta forma, la sensibilidad diagnóstica del ensayo fue de 18% y la especificidad diagóstica fue de 92%. En esta prueba el valor predictivo positivo y negativo fue de 83% y 33% respectivamente, con un riesgo relativo de 2,2 con un CI (0,68-7,15).

Sensibilidad y especificidad diagnóstica del ensayo IgG anti-DPG

La tabla 4 muestra los resultados para IgG anti-DPG. Encontramos que 24 (28,57%) pacientes con condición celíaca y 2 (5,40%) fueron positivos para este marcador. Así también 60 (71,42%) de los pacientes y 35 (94,59%) de los controles fueron negativos para este anticuerpo. Se obtuvo una sensibilidad y especificidad diagnóstica de 29% y 95% respectivamente. Obteniéndose, además, un valor predictivo positivo de 92% y valor predictivo negativo del 37% con un riesgo relativo de 2,2 con un CI (0,68-7,15). Al analizar los resultados de los valores obtenidos para las concentraciones IgA e IgG anti-gliadina y anti-DPG entre pacientes y controles, no se encontraron diferencias significativas para IgA anti-gliadina e IgA/IgG anti-DPG en el grupo de estudio (datos no mostrados). Únicamente se obtuvo diferencias estadisticamente significativas (p<0,001) al comparar los valores de la concentración de IgG anti-gliadina en los pacientes y los controles (Tabla 5). Los valores fueron expresados como Media (x) y Error estándar (ES),

Determinación de IgA total en pacientes celíacos

Se realizó la determinación de IgA total en 45 pacientes celíacos, quienes resultaron IgA anti-DPG e IgA anti-gliadina negativos. De los 45 pacientes, 4 (8,8%) presentaron una concentración de IgA por debajo de los valores de referencia, mientras que la mayoría de los pacientes (91.2%) mostraron resultados normales (Tabla 6).

Determinación de IgA e IgG anti-gliadina y anti-DPG en familiares de individuos celíacos

En la tabla 7 se muestra que 6 (31,57%) de los familiares estudiados resultaron positivos para IgA anti-gliadina y 13 (68,43%) fueron negativos. Con respecto a la IgG anti-gliadina se detectaron 9 (47,37%) positivos y 10 (52,63%) con resultados negativos. Con respecto a los anticuerpos IgA anti-DPG, 6 (31,57%) de los familiares estudiados resultaron positivos y 13 (68,43%) negativos. Para IgG anti-DPG, 4 (21,1%) de los familiares fueron positivos y 15 (78,9%) negativos.

Discusión

Los avances de la última década y el desarrollo de pruebas de detección precisas han dado un impulso notable al diagnóstico precoz no invasivo de la EC. Diversas investigaciones han evaluado la sensibildad y especificidad de las pruebas serológicas del perfil celíaco para lograr mejores resultados en términos de costo-beneficio para el paciente. En este trabajo se estudiaron anticuerpos IgA e IgG anti-gliadina y anti-DPG para evaluar sus ventajas como pruebas diagnósticas al utilizarlos en conjunto con otros marcadores serológicos de la EC. La especificidad diagnóstica para IgA e IgG anti-gliadina obtenida fue del 76% en ambos casos (Tablas 1 y 2), comparable con la de otros estudios, los cuales reportan una especificidad del 80% para IgA y de 75% para IgG (19). En cuanto a la sensibilidad de esta prueba se encontraron valores bajos para la IgA e IgG. Esto podría deberse en parte, que la mayoría de los pacientes se encontraban en dieta libre de gluten de 6 meses a 5 años, lo cual de acuerdo a la literatura, contribuye a disminuir o negativizar los valores para este ensayo. La gliadina es el antígeno encontrado en el gluten y por el cual se desencadena la respuesta de anticuerpos, si este antígeno es eliminado de la dieta los anticuerpos disminuyen, principalmente los de la clase IgA pues son de fase aguda, en tanto se obtendría mayor sensibilidad para los valores de IgG pues esta inmunoglobulina demuestra la respuesta inmunitaria de memoria e indica que el paciente tuvo una reacción previa a la gliadina que permanecerá por cierto tiempo en circulación (19).

Algunos autores han reportado que la baja sensibilidad también podría deberse a que dentro de este grupo se encuentren pacientes celíacos latentes, los cuales, aún siendo celíacos no necesariamente resultan positivos en las pruebas serológicas indicadas para el diagnóstico de EC (20) . Los anticuerpos anti-gliadina han sido estimados como una herramienta serológica útil en el diagnóstico de EC, no obstante, se ha comprobado que no son específicos. De acuerdo a estudios recientes, dichos valores podrían deberse a que estos anticuerpos pueden hallarse en otras condiciones clínicas, como es el caso de la sensibilidad al gluten sin poseer la EC(21); enfermedades no gastrointestinales e incluso en individuos sanos con una dieta rica en gluten (22, 23).

Los anticuerpos anti-DPG se consideran una prueba específica para el diagnóstico de EC y para el seguimiento de pacientes con dieta libre de gluten. En el presente estudio obtuvimos una especificidad del ensayo para IgA e IgG de 92 y 95% respectivamente (Tabla 3 y 4), lo cual es comparable con otras investigaciones que reportan una especificidad con rangos de 97 a 99% (21, 24). En cuanto a la sensibilidad para estos marcadores séricos encontramos valores por debajo de los valores de referencia lo cual podría atribuirse al cumplimiento de una dieta libre de gluten en los pacientes como lo mencionamos anteriormente. Así tambien, se obtuvo un VPP mayor al 80% tanto para la IgA como IgG anti-DPG, esto indica una alta probabilidad de tener la condición celíaca si se obtiene un resultado positivo para este marcador, estos resultados son comparables a los obtenidos por otros autores. Al respecto Sugai y col, en 2006 (25), realizaron un estudio prospectivo, investigando los anticuerpos anti-DPG en pacientes con diagnóstico de EC y los resultados de ese estudio muestran que la sensibilidad y especificidad de las pruebas para anti-DPG IgA e IgG fueron superiores al 90%. Así tambien, Rashtak y col, 2008 (26), compararon la determinación de anticuerpos anti-DPG con la de anticuerpos anti-AtTG y anti-gliadina para establecer su importancia en el diagnóstico clínico de la EC, analizando muestras de pacientes celíacos tratados y no tratados. Sus resultados muestran que la sensibilidad, especificidad y exactitud de los anticuerpos IgA e IgG anti-DPG, en conjunto, fueron superiores a los de anticuerpos anti-gliadina IgA e IgG y similares a los anticuerpos anti-AtTG antes del tratamiento de EC.

Se ha reportado que individuos con deficiencia de IgA tienen 10-15 veces un riesgo incrementado de desarrollar EC y estos sujetos no son detectdos por serología convencional de IgA. La presentación clinica general de EC no difiere entre pacientes deficientes de IgA y otros pacientes, sin embargo, una sobreexpresión de sintomas atípicos y silentes han sido observados entre pacientes deficientes de IgA (27, 28, 29). Por lo tanto, es importante y recomendable solicitar la valoración de IgA total junto a las pruebas específicas del perfil serológico para el diagnóstico de EC. En este estudio se determinaron valores de IgA total en los pacientes celíacos que resultaron negativos para IgA anti-gliadina y anti-DPG. Se detectó un 8% de los pacientes celíacos con valores de IgA total por muy por debajo de los valores de referencia (Tabla 5). Estos resultados son comparables a lo descrito por otros autores (30) y sugieren que la detección de valores bajos de IgA pudiesen estar asociados a la deficiencia selectiva de este anticuerpo, sin embargo, es necesario incrementar la data y realizar otras pruebas clínicas y diagnósticas que pudieran avalar tal presunción.

La prevalencia de la condición celíaca en los familiares de primer grado de pacientes celíacos oscila, entre 5 a 13%, siendo mayor en los familiares que comparten los mismos alelos de riesgo (HLA). Al analizar los resultados de las pruebas del perfil celíaco realizadas a un grupo de familiares en primer grado de los pacientes con condición celíaca, se obtuvo 14 individuos con por lo menos una prueba serológica positiva, de los cuales 10 resultaron positivos para anticuerpos anti-DPG. Estos resultados son comparables a los obtenidos por Landaeta y col en el 2009 (31), quienes realizaron un estudio de prevalencia en 16 familiares celíacos obteniendo valores similares, sin embargo, para tener conclusiones más precisas se requiere realizar estudios adicionales incrementando el número individuos a evaluar. La exactitud diagnóstica de la serología para la EC ha aumentado progresivamente con el desarrollo de pruebas de alta precisión, tales como la detección de anticuerpos IgA anti- AtTG, anti-EMA y anticuerpos IgG anti-DPG. El uso rutinario de estos marcadores serológicos ha permitido a los investigadores diagnosticar un número considerable de casos subclínicos que se caracterizan por serología positiva y biopsias intestinales normales o con lesiones leves. En conjunto, los resultados obtenidos en esta investigación sugieren que la determinación de anticuerpos anti-gliadina y anti-DPG son pruebas útiles para hacer un diagnóstico diferencial entre individuos verdaderos celíacos e individuos potenciales celíacos, parte oculta del iceberg de la EC.

Agradecimientos

El proyecto fue financiado parcialmente por la Coordinación de Investigación de la Facultad de Medicina. Agradecemos a la casa comercial Corpodiagnostica C.A.

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