Acta Científica de la Sociedad Venezolana de Bioanalistas Especialistas

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Artículo original

Detección de ADN de Chlamydophila pneumoniae en líquido cefalorraquídeo proveniente de pacientes diagnosticados con enfermedad de Alzheimer

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  1. Escuela de Bioanálisis de la Universidad Central de Venezuela
  2. Departamento de Biología Molecular del Laboratorio AVILAB
  3. Laboratorio Medico de Referencia
  4. Grupo de Investigación Internacional de Demencia 10/66
Aceptado: 31/03/2012 Publicado: 30/04/2012

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Detección de ADN de Chlamydophila pneumoniae en líquido cefalorraquídeo proveniente de pacientes diagnosticados con enfermedad de Alzheimer

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Resumen

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Detección de ADN de Chlamydophila pneumoniae en líquido cefalorraquídeo proveniente de pacientes diagnosticados con enfermedad de Alzheimer

La Enfermedad de Alzheimer (EA) es un desorden neurodegenerativo y la isoforma 4 de Apolipoproteína E (ApoE) es mundialmente aceptada como un factor de riesgo para el desarrollo de Alzheimer esporádico. La EA se ha asociado con infecciones por Chlamydophila pneumoniae (ChP) debido a que inhibe la respuesta inmune del huésped generando infecciones crónicas. Objetivo: Detectar ADN de ChP en líquido cefalorraquídeo (LCR) de pacientes con diagnóstico clínico de Alzheimer provenientes del Distrito Metropolitano de Caracas. Metodología: se analizaron (7) muestras de LCR de pacientes con diagnóstico clínico de EA y el grupo control estuvo constituido por (13) muestras de LCR de pacientes con Otras Enfermedades Neurológicas (OND) no Demencia. A los cuales se les determino la Isoforma de ApoE, se amplificaron los genes para OmcA y 16Sribosomal de ChP. Resultados: la frecuencia de ApoE isoforma 4 en los pacientes con EA fue (0,57) en contraste con el grupo control donde la frecuencia fue de (0,31)). En todas las muestras analizadas se obtuvo una ausencia de la banda correspondiente a Chlamydophila pneumoniae. Conclusión: la mayor probabilidad es que la bacteria no se encontrara en el LCR de los pacientes. Pero existe la posibilidad de que el ADN de ChP no estuviese en suficiente cantidad como para ser detectado por las técnicas empleadas. Además, debemos considerar que el protocolo de extracción es un punto crítico. Finalmente, los pacientes con diagnóstico clínico de EA y en particular del género femenino tienen mayor frecuencia de tener una copia de ApoE isoforma 4 en su genotipo.

Palabras clave: Enfermedad de Alzheimer, Apolipoproteína E y Chlamydophila pneumoniae.

DNA detection of Chlamydophila pneumoniae in cerebrospinal fluid of patients diagnosed with Alzheimer Disease

Alzheimer’s Disease (AD) is a neurodegenerative disorder and the isoform 4 of apolipoprotein E (ApoE) is world accepted as a risk factor for developing sporadic Alzheimer. The AD has been associated with infections by Chlamydophila pneumoniae (ChP) because it inhibits the host immune response causing chronic infections. Objective: to detect ChP DNA in cerebrospinal fluid (CSF) of patients with clinical diagnosis of Alzheimer’s from the Metropolitan District of Caracas. Methodology: We Analyzed (7) CSF samples from patients with clinical diagnosis of AD and control groups consisted of (13) CSF samples from patients with other neurological diseases (OND) no dementia. To which the determined the isoform of ApoE genes were amplified for OmcA and 16sribosomal of ChP. Results: the frequency of ApoE isoform 4 in AD patients was (0.57) in contrast to the control group where the frequency was (0.31). All samples were obtained an absence of the band corresponding to Chlamydophila pneumoniae. Conclusion: the greater likelihood is that the bacteria is not found in the CSF of patients. But there is the possibility that DNA was not ChP insufficient quantity to be detected by the techniques employed. Furthermore, we most consider the extraction protocol is a critical point. Finally, patients with clinical diagnosis of AD and in particular the female are more often have a copy of ApoE isoform 4 in its genotype.

Keywords: Alzheimer’s disease, apolipoprotein E, Chlamydophila pneumoniae.

Introducción

Conocer que el principal factor de riesgo para padecer la EA, es tener una edad mayor a 65 años (1), y que además suele ser la causa más frecuente de demencia en ancianos, ya que representa del 50 al 75% de los casos (2), no es un futuro alentador; diferenciar entre EA y otros tipos de demencias que cursen con signos y síntomas iguales significa un reto, para el personal del área de la salud. Venezuela no escapa de esta realidad siete de cada cien ancianos tienen demencia senil y/o demencia tipo Alzheimer, según lo que describe el Grupo de Investigación Internacional de Demencia 10/66 (2009)(1) .

El deterioro cognitivo leve, es el estado clínico de transición entre el envejecimiento normal y el envejecimiento por EA (3). Por su parte la EA es una enfermedad neurodegenerativa. El marcador genético que actualmente se realiza en el país es la determinación de la isoforma de ApoE cuya principal fuente a nivel de Sistema Nervioso Central es el astrocito (2). Su función primordial radica en la homeostasis lipídica, mantenimiento de la neuroplasticidad, modulación de la actividad del péptido beta-amiloide y acción antiinflamatoria. La isoforma 4 de ApoE ha sido mundialmente aceptada como un factor de riesgo para el desarrollo de Alzheimer esporádico (4). La EA es una enfermedad multifactorial. En el caso de los procesos infecciosos, ChP ha sido uno de los principales microorganismos investigados. Esto se puede deber a la capacidad de inhibir la respuesta inmune del huésped generando infecciones crónicas (5,6,7).

Metodología

La población consultada consistía en pacientes con deterioro cognitivo. Los pacientes seleccionados cumplían con los siguientes requisitos:

  • Diagnóstico de imagen compatible con EA.
  • Estudios de laboratorio donde se demuestre que la demencia no tiene causa conocida.
  • Evaluación del deterioro cognitivo.
  • Ser mayores de 50 años.

El grupo de control estuvo integrado por 13 muestras de LCR de aspecto límpido, incoloros y un contaje celular menor a 5 células por mm3 proveniente de pacientes de diferentes edades con otras enfermedades neurológicas no demencia.

En la tabla 1 se muestra la procedencia de las muestras empleadas.

Tabla 1. Procedencia de las muestras empleadas

Tabla 1. Procedencia de las muestras empleadas

Las 7 muestras de LCR con diagnóstico clínico EA y las 13 muestras de LCR con Otras Enfermedades Neurológicas no Demencia, fueron transportadas a 4°C y refrigeradas a -70°C hasta su procesamiento. Las muestras fueron sometidas a un pre-tratamiento en el cual se centrifugo 16.000 g., por 15min. El sedimento que se obtuvo se trato con 20ul de Proteinasa K, este se mezcla en el vortex brevemente y después se coloca en el baño de maría seco a una temperatura de 60°C por 30min. Seguidamente se realizó el protocolo de Extracción de AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit. Se uso la técnica de PCR para la detección de ADN de Chlamydophila pneumoniae (Gen de Amplificación OmcA y 16Sribosomal) y para la genotipificación de ApoE (técnica INNO LiPA ApoE de Innogenetics).

Resultados

De la población consultada el grupo de pacientes con diagnostico clínico de EA tienen una frecuencia 0,57 de presentar una copia del alelo 4 del gen de ApoE representado un 57% mientras que el grupo control constituido por pacientes con OND no demencia tienen una frecuencia 0,31 de presentar una copia del alelo 4 del gen de ApoE representando un 31%.

Figura 1. Distribución de muestras con Despistaje de ChP negativo por isoforma de ApoE en las muestreas del grupo de pacientes en estudio y el grupo control.

Figura 1. Distribución de muestras con Despistaje de ChP negativo por isoforma de ApoE en las muestreas del grupo de pacientes en estudio y el grupo control.

De la población consultada los pacientes con diagnóstico clínico de EA, del género femenino presentaron una frecuencia 0,75 mientras que los del género masculino presentaron una frecuencia 0,25.

Figura 2. Distribución de muestras con Despistaje de ChP negativo por isoforma de ApoE y género en las muestreas del grupo de pacientes en estudio y el grupo control.

Figura 2. Distribución de muestras con Despistaje de ChP negativo por isoforma de ApoE y género en las muestreas del grupo de pacientes en estudio y el grupo control.

El despistaje para Chlamydophila pneumoniae en las 13 muestras analizadas del grupo control resulto negativo.

Figura 3. Electroferograma en gel de Agarosa al 2% de los productos de amplificación de los pacientes con OND no demencia usando la técnica Pneumobacter de Seeplex.

Figura 3. Electroferograma en gel de Agarosa al 2% de los productos de amplificación de los pacientes con OND no demencia usando la técnica Pneumobacter de Seeplex.

El despistaje para Chlamydophila pneumoniae de las 7 muestras con diagnostico clínico de EA resulto negativo por ambas metodologías.

Figura 4. Electroferograma en gel de Agarosa al 2% de los productos de amplificación de los pacientes con Diagnostico Clínico de EA usando la técnica Pneumobacter de Seeplex.

Figura 4. Electroferograma en gel de Agarosa al 2% de los productos de amplificación de los pacientes con Diagnostico Clínico de EA usando la técnica Pneumobacter de Seeplex.

Figura 5. Electroferograma en gel de Agarosa al 2% de los productos de amplificación de los pacientes con Diagnostico Clínico de EA usando la técnica Maxin Biotech

Figura 5. Electroferograma en gel de Agarosa al 2% de los productos de amplificación de los pacientes con Diagnostico Clínico de EA usando la técnica Maxin Biotech

Revelado por Hibridación Reversa de la Genotipificación de ApoE de los pacientes con Diagnóstico clínico de EA

Discusión

En el presente estudio corrobora que la mayor frecuencia de ApoE alelo 4 lo presenta los pacientes con diagnóstico clínico de EA y en particular los del género femenino, similar al reportado por otros investigadores [2,5,8,9,10,11].

No se detectó ADN de ChP en los pacientes con OND no demencia y los pacientes con diagnóstico clínico de EA con las técnicas empleadas.

Las causas por la cual no se observo la banda de ChP se debe a que la misma no estaba en el LCR de los pacientes con EA o por la cantidad insuficiente de ADN de ChP causando que no pudieran ser detectada por las técnicas empleadas. Ha sido reportado que las altas concentraciones de Interferón- gamma y los agentes antimicrobianos causan que ChP no este en cantidad suficiente en los pacientes con EA. Porque ambas inhiben la fase replicativa (12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23).

Finalmente debemos considerar que el proceso de extracción es un punto crítico, en este sentido el protocolo fue efectivo para extraer el ADN de ApoE mas pudiera ser que no fuese el adecuado para extraer el ADN de ChP por las características de la misma.

Referencias

  1. Siete de cada cien ancianos sufre demencia o Alzheimer. El Universal. En prensa Agosto 2009.
  2. Alzheirmer’s Disease International. World Alzheimer report 2009. Available from: URL: http://www.alz.co.uk/research/worldreport. Consultado: el 23 de enero de 2010.
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