Valor pronóstico de los niveles séricos del Receptor d soluble de Interleuquina-2 en pacientes con Linfoma No Hodgkin

Introducción

Los Linfomas No-Hodgkin (LNH) comprenden un variado espectro de desórdenes linfoproliferativos con diferentes comportamientos clínicos y características biológicas (1-4).

Recientemente se ha avanzado en la investigación de los aspectos biológicos de esta malignidad, asociados al estudio de las citoquinas, sus receptores solubles y su relación con la patogénesis (5). En tal sentido una serie de estudios han sugerido la significancia del receptor alfa soluble de la Interlequina-2 (sRdIL-2) como marcador pronóstico en LNH (6).

El receptor alfa de la IL-2 es producido por linfocitos T y B activados y está compuesto por tres glicoproteinas (d, e, g) (7). La cadena d de peso molecular 55 KD referida como antígeno Tac (CD25) funciona como un receptor de baja afinidad, compuesto por 351 aminoácidos de los cuales 13 se localizan intracitoplasmáticamente.

El sRdIL-2 corresponde a una porción truncada de la cadena alfa del antígeno Tac (CD25), el cual es menor que su contraparte celular (45KD vs 55KD), pero es capaz de unirse a la IL-2 eficientemente. La cadena e es una glicoproteina de 575 aminoácidos de peso molecular de 75 KD y las cadenas e y gson receptores de moderada afinidad (8). El sRdIL-2 no se expresa en células en reposo, la activación de las células T por antígeno o mitógeno induce su expresión en la superficie de los linfocitos T y es liberado por efecto de una proteasa (9).

La interleuquina 2 (IL-2) fue descrita en el sobrenadante de cultivos de células activadas y está involucrada en la inmunoregulación, promoviendo la proliferación de los linfocitos T. La IL- 2 se combina específicamente con su receptor sobre la superficie de los linfocitos T e induce la respuesta celular (8,9).

Debido a que el sRdIL-2 es producido por linfocitos activados, su nivel sérico es índice de activación linfocitaria y en consecuencia se han detectado niveles incrementados en pacientes con malignidades hematológicas como leucemias y linfomas (10-15).

La identificación de pacientes con LNH, con diferentes posibilidades de respuesta al tratamiento, es crítico para el desarrollo de las terapias según el índice de riesgo de la enfermedad. En tal sentido, el Índice Pronostico Internacional (IPI) ha sido el modelo predictivo utilizado para la categorización de los pacientes con LNH en grupos de riesgo. El IPI incorpora cinco factores pronósticos: la edad, el estado funcional del paciente, el estadio clínico, la actividad de la Lactato deshidrogenasa (LDH) y el número de lesiones extranodales (16).Inicialmente fue aplicado a los LNH agresivos y posteriormente fue validado para todos los grados de malignidad (17). No obstante, la precisión de dicho modelo predictivo pudiera complementarse con la combinación de marcadores biológicos adicionales asociados al tumor, de allí la importancia de determinar los niveles del sRdIL-2 y evaluar su utilidad como marcador tumoral en LNH.

Materiales

Pacientes: Se evaluaron 43 pacientes con diagnóstico de Linfoma No-Hodgkin (LNH) confirmados clínica e histopatológicamente, los cuales acudieron a la consulta de Linfoma del Instituto de Oncología y Hematología U.C.V.-Ministerio de Salud., durante el periodo 1999 - 2004, siendo el tiempo promedio de seguimiento de la enfermedad de 30 meses (rango 3-48 meses). Se incluyeron pacientes que no recibieron tratamiento previo de la enfermedad, con serología negativa para VIH, excluyéndose los pacientes con LNH previamente tratados o con enfermedades asociadas tipo diábetes, insuficiencia renal u otras, y aquellos con serología positiva para VIH.

Los pacientes se clasificaron histopatológicamente según la clasificación de la Organización Mundial de la Salud (OMS) (18). Para la estadificación clínica se aplicó el sistema de clasificación de ANN ARBOR: siendo los estadios I-II (enfermedad localizada) y estadios III-IV (enfermedad avanzada). El estado funcional de los pacientes se determinó aplicando la escala de Karnosfky (19). De acuerdo al IPI se clasificaron los grupos de riesgo: bajo riesgo (bajo riesgo e intermedio bajo) y alto riesgo (riesgo intermedio alto y alto riesgo). En la práctica clínica con fines pronósticos los LNH se subdividieron en las categorías de linfomas indolentes y agresivos (3).

Grupo control: Se incluyeron 20 individuos aparentemente sanos, donantes de Banco de Sangre, para establecer los valores de referencia (VR) de los niveles séricos del sRdIL-2.

Evolución clínica: Los pacientes se trataron con esquemas de primera línea establecidos internacionalmente para los Linfomas No Hodgkin (1).

Para la evaluación clínica se aplicaron los siguientes criterios:

Remisión completa (RC): se define como la desaparición de todas las manifestaciones clínicas y signos de la enfermedad, con normalización de las alteraciones radiológicas y de los datos bioquímicos que fueran anormales antes de iniciar la quimioterapia. Una vez finalizado el tratamiento, la respuesta se mantendrá, al menos tres meses. En caso de infiltración de la medula ósea, la desaparición de la enfermedad morfológica/histológica, deberá ir unida a normalización de las cifras hematológicas periféricas (>12 g/dl de Hb, >100.000 plaquetas/mm3 y >1.500 granulocitos/mm3).

Remisión parcial (RP>50): Se define como la reducción del 50% o más de la enfermedad medible durante al menos un mes. Debe haber ausencias de citopenias periféricas.

Progresión: Aumento en la frecuencia o en la severidad de los síntomas, o aparición de nuevas áreas afectadas, o progresión de más de un 25% en las localizaciones tumorales iniciales.

Sobrevida global (SG): Es el tiempo transcurrido desde que se hace el diagnóstico y se inicia o no un tratamiento, hasta la muerte ocasionada por la enfermedad inicial que se está evaluando o hasta la fecha del último control.

Sobrevida libre de enfermedad (SLE): Es el tiempo transcurrido entre la fecha RC y la nueva aparición de síntomas y signos de enfermedad (recaída).

Métodos

Las muestras de sangre se obtuvieron por punción venosa, una sola toma de muestra antes de la administración del tratamiento. Para la muestra de sangre total se utilizaron tubos con anticoagulante EDTA y para la obtención del suero tubos estériles sin anticoagulante, los cuales se centrifugaron a 2500 rpm, por 10 min. y se almacenaron a -70°C hasta su procesamiento. Las muestras de suero de pacientes y controles se procesaron bajo las mismas condiciones.

LDH, AST, ALT Y FALC: Las enzimas se analizaron por métodos cinéticos UV, utilizando un autoanalizador de química sanguínea (Hitachi modelo 704 Roche): ALT (VR: <38 u/l, Roche catálogo N° 851121); AST (VR: <41 u/l, Roche catálogo N° 851132); FALC (VR: <290 u/l, Roche catálogo N° 816388).

LDH (VR: 80-285 u/l, Invelab catálogo N° 89289). La actividad de la LDH se consideró elevada para valores >570 U/L, correspondiendo al 100% del valor superior del rango de referencia, según lo establecido por el IPI, en pacientes con LNH (16).

PCR: se aplicó método de aglutinación directa semicuantitativo (Wiener Lab. catálogo N° 006531). VR: <6 mg/dl.

B2M: Se determinó mediante el método de inmunoensayo enzimático sobre micropartículas (MEIA), sistema IMX. (Abbot, cat N° 69-2197/R11). VR: <3,4 mg/dl.

Determinación de indicadores hematológicos: Hemoglobina, Hematocrito, Recuento celular, Formula leucocitaria, y Velocidad de Sedimentación globular (VSG) por el método Wintrobe 1 hora, VR: 0-15 mmh.

Receptor alfa soluble de la Interleuquina 2 (sRdIL-2): Los niveles séricos del sRdIL-2 se determinaron en las muestras de pacientes y controles sanos aplicando un inmunoensayo enzimático adsorbente (ELISA), modalidad sándwich, (Quantikine Human IL-2sRá catálogo Nº DR2A00). Se empleó un anticuerpo monoclonal de captura específico para el sRdIL-2, adherido a la placa de ELISA. Las muestras, estándares y el conjugado, se incubaron en cada pozo formándose un complejo: anticuerpo de captura – antígeno - conjugado (anticuerpo policlonal anti sRdIL-2- enzima). Posterior a los lavados para remover los reactivos y muestras no ligadas, se añadió el sustrato, produciéndose el desarrollo de color, cuya intensidad es proporcional a la concentración del sRdIL-2 combinado. El desarrollo del color se detuvo con el reactivo de parada y la intensidad del color se detectó en un densitómetro a la longitud de onda de 450nm, siendo el nivel de sensibilidad del ensayo de 10 pg/ml.

Análisis estadístico

Se aplicaron las pruebas estadísticas no parámetricas: Test U-Mann-Whitney para determinar las diferencias en el comportamiento del marcador entre los grupos, expresados por la mediana y el coeficiente de correlación de Spearman rank-sum para determinar la correlación entre los factores pronósticos. Se aplicó la prueba exacta de Fisher para el análisis de las frecuencias y para las curvas de sobrevida el método de Kaplan–Meier y la prueba de Log-rank para el análisis univariado. La significancia estadística se estableció en p=0,05

Resultados

Características clínico-patológicas y biológicas de los pacientes con LNH

En la Tabla 1 se muestran las características clínico- patológicas de los pacientes evaluados. De acuerdo a los factores de mal pronóstico, 33% de los pacientes presentaron edades mayores de 60 años, 58% de sexo femenino, 60% con estadio clínico III-IV (enfermedad avanzada), 7% estado funcional alterado, 63% con afectación extraganglionar >1 región, 47% presentaron síntomas B, 70% enfermedad voluminosa mayor de 10 cm, y el 19% y 63% con compromiso de médula ósea y abdominal respectivamente. Según la histología del tumor, el 56% correspondió al subtipo histológico Linfoma difuso de células grandes tipo B, 9% al subtipo Linfoma folicular y el 12 % al Linfoma linfocítico pequeño. En relación a las categorías pronósticas, el 77% correspondió a LNH agresivos y el 23% a LNH indolentes. Con respecto al IPI, el 86% se categorizó de bajo riesgo y el 14% de alto riesgo.

En relación a la frecuencia de los marcadores biológicos alterados, en base al valor límite de referencia (cut-off), el 12%, 28%, 7%, 9%, 23%, 49%, 93% y el 61% de los pacientes presentaron respectivamente niveles elevados de LDH, B2M, AST, ALT, FALC, PCR , VSG e IL-6 y el 79% niveles bajos de Albúmina sérica.

Niveles séricos del sRdIL-2 en pacientes con LNH: Los pacientes con LNH presentaron valores séricos del sRdIL-2 significativamente superiores a los del grupo control , p< 0,001 (Tabla 2 ).

Tomando en cuenta el valor de referencia obtenido en el grupo control, de los 43 pacientes evaluados, 26 (60%) presentaron niveles significativamente elevados del sRdIL-2 (>2000 pg/ ml) comparados con 17(40%) de los pacientes con valores del sRdIL-2 < 2000 pg/ml, p< 0,001 (Tabla 3 ).

Asociación de los niveles séricos de sRáIL-2 con las características clínico-patológicas y biológicas de los pacientes con LNH

En la Tabla 4, observamos que los pacientes con estadio clínico III-IV cursaron con valores del sRdIL-2 significativamente superiores comparados con el grupo de pacientes con estadio clínico I-II , p = 0,02. Los niveles del sRdIL-2 fueron significativamente elevados en el grupo de pacientes que presentaron los síntomas B ( fiebre, sudoración nocturna y pérdida de peso), respecto al grupo con ausencia de los síntomas, p= 0,04. No se obtuvieron diferencias significativas relacionadas con la edad, el estado funcional, la enfermedad extraganglionar, la enfermedad voluminosa, el compromiso de médula ósea, la enfermedad abdominal y el IPI.

En cuanto a los marcadores biológicos (Tabla 5), los niveles del sRdIL-2 en el grupo de pacientes con concentraciones elevadas de B2M, fueron significativamente superiores comparados con los niveles del receptor en el grupo de pacientes con valores normales de B2M, p=0,01. También se observaron valores del sRdIL-2 significativamente aumentados, asociados al grupo de pacientes con niveles elevados de PCR respecto al grupo de pacientes con valores normales de PCR, p= 0,05.

No se obtuvieron resultados significativos asociados a los valores de LDH, AST, ALT, FALC, Albúmina, VSG e IL-6.

Correlación de los niveles séricos de sRdIL-2 con las características clínico- patológicas y marcadores biológicos en los pacientes con LNH

Los niveles del sRdIL-2 correlacionaron de forma directa y significativa con el estadio clínico de los pacientes (r=0,33 p=0,047) y la presencia de síntomas B (r=0,42 p=0,05). No se determinaron correlaciones significativas para el resto de las condiciones clínicas evaluadas (Tabla 6).

El análisis de correlación con los marcadores biológicos mostró que los niveles del sRdIL-2 correlacionaron siginificativamente con los valores de B2M (r= 0,42 p=0,05) y PCR en forma directa (r=0,30 p= 0,05), no habiéndose detectado correlaciones significativas con el resto de los marcadores biológicos (Tabla 7).

Niveles séricos de sRdIL-2  pretratamiento y evolución clínica

De acuerdo a la evolución clínica, el 16% de los pacientes entraron en remisión completa, 19% respondieron parcialmente, 8% progresaron y 22% fallecieron. Se detectaron niveles elevados del sRdIL-2 (>2000 pg/ml) en el 38% de los pacientes con respuesta completa, 58% de los pacientes con respuesta parcial, 50% de los pacientes que progresaron y en el 68% de los fallecidos, pero estos resultados no fueron estadísticamente significativos.

Niveles séricos de sRdIL-2 y sobrevida

El análisis unívariado de la sobrevida global de acuerdo a los niveles séricos del sRdIL-2 en los pacientes con LNH agresivos, indicó que para el tiempo de seguimiento de 4 años, los pacientes con valores elevados del sRdIL-2 (>2000 pg/ml) presentaron una probabilidad de sobrevida (18%) significativamente inferior comparada con la probabilidad de sobrevida global (59%) del grupo de pacientes con valores normales del sRdIL-2, p = 0,048 (Figura 1).

El tamaño de la muestra y la distribución de los datos (vivos y fallecidos), fueron limitantes para el análisis de la sobrevida en el grupo de los linfomas indolentes, igualmente para las curvas de la sobrevida libre de enfermedad en ambos grupos pronósticos (datos no mostrados).

Discusión

La profundización en el estudio de los factores pronósticos biológicos que complementan la información aportada por el IPI en pacientes con LNH ha adquirido un interés considerable.

EL sRdIL-2 se presenta en la literatura particularmente como un marcador biológico predictivo asociado con la sobrevida global y la respuesta al tratamiento en pacientes con LNH (11,12,14,15).

En el presente estudio, los pacientes con LNH presentaron niveles séricos del sRdIL-2 significativamente elevados antes de iniciar el tratamiento. La asociación de su incrementada expresión con el estadio clínico III-IV, síntomas B, niveles elevados de B2M y PCR, coinciden con los hallazgos previamente reportados en pacientes con LNH (11-15,23,24), de los cuales solo en el estudio de Pérez-Encina M., et al. (12) se analizaron pacientes con LNH agresivos, LNH indolentes y el grupo total, observándose una asociación significativa entre los niveles elevados del sRdIL-2 y el estadio clínico (enfermedad avanzada) en los tres grupos evaluados y una asociación con los síntomas B con el grupo total y los linfomas agresivos. La relación del sRdIL-2 con el estadio clínico y la B2M es reflejo de la diseminación y proliferación del proceso tumoral y la asociación con los síntomas B y los niveles elevados de la PCR, nos indican su relación con la respuesta del paciente al tumor, el estado de inflamación y la activación celular.

Si bien el incremento en la expresión del sRdIL-2 no es un marcador específico de malignidad ya que los linfocitos y monocitos activados expresan el receptor (9,21), en nuestro trabajo los niveles del sRd IL-2 correlacionaron significativamente y de forma directa con las condiciones clínicas que reflejan la progresión y expansión de la enfermedad así como con las concentraciones de B2M, marcador biológico que refleja la actividad proliferativa del tumor. Estos resultados coinciden con los hallazgos de Pérez-Encina M., et al. (12), quienes demostraron la misma correlación en los tres grupos de pacientes evaluados. Estas observaciones apoyan la hipótesis de que la acumulación del sRdIL-2 en la sangre de los pacientes con LNH es consecuencia directa de su liberación por las células tumorales (22). También observamos la correlación directa entre el sRdIL-2, presencia de síntomas B y la PCR, lo cual refleja el estado de activación del sistema inmune y la respuesta inflamatoria, en la cual también participan las citoquinas pro-inflamatorias tales como la interleuquina -6 (IL-6) y el factor de necrosis tumoral (TNF) y sus receptores solubles, favoreciendo el estado de inflamación general (6,20,23).

En relación a los grupos pronósticos y los niveles del sRdIL-2, no se observaron diferencias entre los linfomas agresivos y los indolentes, contrario a los resultados de Pérez-Encina M., et al. (12), quienes reportaron niveles superiores del sRdIL-2 en los linfomas agresivos. En dicho trabajo el número de pacientes era comparable entre los grupos, no siendo así en nuestro caso, pudiendo influir esto en la significancia estadística, a pesar de las diferencias entre los valores de las medianas entre ambos grupos y el efecto de la distribución de los datos.

En nuestro estudio, si bien una proporción significativa de pacientes presentaron niveles del sRdIL-2 pretratamiento incrementados, no se observaron resultados significativos relacionados con la evolución clínica, probablemente debido al bajo número de pacientes.

En el análisis univariado de la sobrevida global, nuestro estudio determinó el valor pronóstico para el sRdIL-2. Los pacientes con LNH agresivos que expresaron niveles elevados del sRdIL-2 cursaron con una menor probabilidad de sobrevida global en comparación con el grupo de pacientes con niveles normales del sRdIL-2, no obstante no se demostró su valor pronóstico independiente en el análisis multivariado. Fabre-Guillevin E., et al. (15) reportaron resultados similares correlacionados con la sobrevida global, remisión completa y sobrevida libre de enfermedad, basados en valores de cut-off diferentes (< 110 pg/ml ), además en su trabajo analizaron los grupos de riesgo según el IPI de acuerdo a los niveles del sRdIL-2 y sus observaciones indicaron una menor sobrevida global y remisión completa en pacientes de riesgo intermedio con altos niveles del sRdIL-2. Por otra parte, Goto H., et al. (14) reportaron disminución de la probabilidad de sobrevida global en los pacientes con niveles elevados del sRdIL-2 (>2000 U/ml) en comparación con los pacientes con bajos niveles del mismo, mostrando ser un marcador independiente de la sobrevida global. Adicionalmente, al combinarlo con el IPI, sus resultados indicaron una menor probabilidad de sobrevida global en los pacientes con niveles elevados del sRdIL-2 y grupos de alto riesgo. Nitsu N., et al. (11) obtuvieron resultados concordantes con los nuestros respecto a la sobrevida global asociada a niveles elevados del sRdIL-2 (> 2000 U/ml y >3000 U/ml) y cuando se combinaron con el IPI no obtuvieron resultados significativos para la sobrevida global, no obstante el análisis multivariado mostró la independencia del marcador. El trabajo de Chopra G.S., et al. (5) coincide con el nuestro en cuanto al valor pronóstico del sRdIL-2 pretratamiento y además en su estudio determinaron niveles incrementados durante el tratamiento en pacientes con respuesta parcial y progresión de la enfermedad. Stasi R., et al. (25) determinaron diferencias significativas respecto a los niveles del sRdIL-2 entre pacientes con LNH respondedores y no respondedores.

Debido a la variabilidad de los resultados entre los trabajos reportados, es importante considerar los factores que determinan estas diferencias y dificultan la comparación de los mismos (15), tales como el tamaño de la muestra, las características clínico patológicas, la histología del tumor y la heterogeneidad de los subtipos histológicos, siendo recomendable la clasificación de la OMS para la posterior categorización de los grupos pronósticos. Desde el punto de vista metodológico, el método utilizado, la variabilidad de los criterios para establecer el valor del cut-off , así como el análisis estadístico aplicado, son determinantes en la reproducibilidad de los resultados.

En el presente estudio evaluamos la utilidad de la determinación de los niveles séricos del sRdIL-2 en pacientes con LNH. Los resultados sugieren que su expresión refleja el comportamiento biológico del tumor, la progresión y actividad de la enfermedad, considerándose la expresión de los niveles elevados, un marcador de mal pronóstico para la sobrevida global en los pacientes con LNH agresivos.

La profundización en el comportamiento de los niveles séricos del sRdIL-2 en los pacientes con LNH, permitiría complementar la información aportada por el IPI para la categorización de los pacientes y la selección de las estrategias terapéuticas.

Agradecimiento

Agradecemos al profesor Leovigildo García, profesor jubilado de la Cátedra de Matemática y Bioestadística de la Escuela de Bioanálisis. Facultad de Medicina, Universidad Central de Venezuela, por la asesoría estadística.

Agradecemos a la Fundación BADAN por el financiamiento del estudio estadístico.

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