Introducción
Las infecciones nosocomiales representan hoy en día una de las complicaciones mas comunes que afectan el ambiente hos-pitalario, generalmente estas infecciones son ocasionadas por microorganismos que han acumulado determinantes de resis-tencia mediante un acelerado proceso selectivo, ejercido por el uso y el abuso de los antimicrobianos como agentes tera-péuticos y profilácticos dentro del recinto hospitalario (1).
Un aspecto importante de la epidemiología de las infecciones nosocomiales es comprender como se diseminan las cepas bacterianas involucradas y los determinantes de resistencia, dentro de un hospital e incluso en hospitales de un área deter-minada, la determinación de la relación genética entre los patógenos nosocomiales ha sido utilizado para la vigilancia epidemiológica (2).
En los últimos años se han desarrollando nuevas técnicas moleculares de tipificación basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que han representado un avance im-portante en el estudio de las enfermedades infecciosas, siendo muy útiles al permitir discriminar serotipos estrechamente re-lacionados y grupos de cepas no relacionadas clonalmente, debido a su gran poder discriminatorio.
Los métodos genotípicos epidemiológicos están basados en el estudio del ADN, cromosómico o extracromosomico. En la tipificación molecular se comparan las secuencias nucleotídicas de los microorganismos de manera directa e indirecta, permi-tiendo determinar la relación clonal entre cepas de una misma especie bacteriana. Una alternativa para genotipificar son las técnicas basadas en la amplificación de secuencias de ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (3).
El genoma de las enterobacterias contiene dos tipos de secuen-cias cortas, repetidas y esparcidas, llamadas ERIC (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus) y secuencias REP (Repetitive Extragenic Palindromic), las cuales han sido usadas ampliamente en tipificación, análisis genético y en la iden-tificación de brotes infecciosos bacterianos (4-6). Estos análisis están basados en la amplificación de las secuencias de ADN a través de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), usando cebadores específicos para cada tipo de secuencia. El polimorfismo detectado resulta de la variabilidad en la repeti-ción de dichas secuencias y de la distancia entre copias conti-guas causadas por inserciones o deleciones del ADN. Usando estas secuencias ha sido posible, discriminar serotipos estrecha-mente relacionados de la misma especie, y grupos de cepas no relacionadas clonalmente, ya que poseen un gran poder discriminatorio (4).
El objetivo de este trabajo consistió en genotipificar mediante REP PCR y ERIC-PCR, cepas de E. coli y de Klebsiella pneumoniae provenientes de aislados nosocomiales de cuatro centros de salud del área metropolitana de Caracas.
Materiales y métodos
Aislados baterianos y métodos bacteriológicos
Se recolectaron 60 cepas de Escherichia coli y 26 cepas de Klebsiella pneumoniae aisladas de pacientes hospitalizados en cuatro centros de salud del área metropolitana de Caracas: Hos-pital “Dr. José María Vargas” Hospital “Dr. Domingo Luciani”, “Centro Médico de Caracas” y “Policlínica Metropolitana”.
Susceptibilidad antimicrobiana: se empleó el método de difu-sión en disco siguiendo los lineamientos propuestos para enterobacterias por la CLSI. La cepa E.coli ATCC (25922) fue utilizada como control de calidad de las pruebas de susceptibilidad.
Lisados celulares de las cepas nosocomiales: como templado para la reacción de PCR, se utilizó ADN total proveniente de la preparación de lisados celulares obtenido mediante el mé-todo de Levesque et. al. (5).
Genotipificación de las cepas nosocomiales
ERIC-PCR: se emplearon iniciadores que hibridan las se-cuencias consenso repetitivas intergénicas de enterobacterias (secuencias ERIC). Las secuencias de los iniciadores son: ERIC1 5’-ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C-3’ y ERIC2: 5’-AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G-3’.Se utilizaron condiciones estándar en la PCR. Los parámetros empleados fueron: una desnaturalización inicial a 94ºC por 5 minutos, seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC por 1 minu-to, temperatura de hibridación a 45ºC por 1 minuto, y una extensión a 72ºC por 2,5 minutos, con una extensión final a 72°C por 7 minutos (4).
REP-PCR: se empleó un iniciador que hibrida con las se-cuencias repetitivas palindrómicas extragénicas (secuencias REP) cuya secuencia es REP 1: 5’-GCG CCG ICA TGC GGC ATT-3’ Se utilizaron condiciones estándar en la PCR. Los parámetros empleados fueron: desnaturalización de 95ºC por 1 minuto, seguidos de 30 ciclos de 94ºC por 1 minuto, 38ºC por 1 minuto y 65ºC por 8 minutos, con una extensión final de 65ºC por 15 minutos (6,7) (Figura 1).
Figura 1. Iniciador REP- PCR hibrida específicamente con secuencias REP distribuidas aleatoriamente en el cromosoma bacteriano. Múltiples fragmentos de diferen-tes longitudes son amplificados. Los fragmentos amplifi-cados son separados por tamaño y carga, obteniéndose un único perfil REP-PCR, el cual contiene múltiples bandas de varios tamaños e intensidad.
Criterios de interpretación
Las cepas fueron agrupadas según las relaciones clonales, esta-blecidas por ambas técnicas. Se utilizó la clasificación de inter-pretación establecida por Tenover et al. Fundamentada en los eventos genéticos como mutaciones puntuales, inserciones ó deleciones que pueden ocurrir de manera espontánea y al azar que pueden alterar el patrón de bandas (8).
Resultados
En el Centro Médico de Caracas se determinó que 4 cepas las 25,35,40 y 43 eran clones genéticamente relacionados (Figura 2-A), todas estas cepas fueron aisladas de pacientes ubica-dos en el área de hospitalización y 3 asociadas a sepsis. El perfil de resistencia de estas cepas relacionadas genéticamente es variable (Tabla 1).
Figura 2-A. Patrones de bandas obtenidas con ERIC-PCR, de los aislados provenientes de la Policlínica Metropolita-na de Caracas. Carril 1: marcador de peso molecular 1kb; carril 2: E. coli 51; carril 3: E. coli 52; carril 4: E. coli 54 ;
carril 5: E. coli 55 ; carril 6: E. coli 57; carril 7: E. coli 58;
carril 8: E. coli: 59; carril 9:E. coli 60; carril 10: E. coli 61.
Figura 2-B. Patrones de bandas obtenidas a través de REP-PCR, de los aislados nosocomiales de la Policlínica Me-tropolitana de Caracas. Carril 1: Marcador de peso molecular 1 kb; carril 2: control negativo; carril 3: E. coli 51, carril 4: E. coli 52; carril 5: E. coli 57; carril 6: E. coli
58; carril 7: E. coli 59; carril 8: E. coli 60; carril 9: E. coli
61; carril 10: E. coli 62; carril 11: E. coli 55; carril 12: E. coli 64.
Tabla 1: Cepas de E. coli y K. pneumoniae con relación clonal, establecidos por REP-PCR y ERIC-PCR, pertenecientes a 4 centros de salud del área metropolitana de Caracas.
HP: hospitalización; UTIN: Unidad de Terapia Infantil; UTA: Unidad de Terapia de Adulto; UCIN: Unidad de Cuidados Intermedios; CIR: Cirugía. AMP: Ampicilina; CAZ: Ceftazidima; CTX: Cefotaxime; CRO: Ceftriaxone; KF: Cephalotin; PIP: Piperacilina; SAM: Ampicilina/Sulbactan; FEP: Cefepime; CIP:Ciprofloxacina; MEN: Meropenen; SXT: Sulphamethoxazole/Trimethoprim ; C: Cloranfenicol; TE: Tetraciclina C.M.C: Centro Médico de Caracas; P.M: Policlínica Metropolitana; H.D.L: Hospital “Dr. Domingo Luciani”; H.J.M.V: Hospital “Dr. José Maria Vargas”.
En la Policlínica Metropolitana se encontraron un grupo de clones de E. coli estrechamente relacionados, estás son la 51,52,57,58 y 59. Las cepas 51 y 52, fueron clasificadas como aislados genéticamente indistinguibles, al igual que las cepas 57 y 58 (Figura 2-B). Los perfiles de resistencia entre las cepa 51/52 y 57/58 son idénticos. Las cepas fueron aisladas en pacientes ubi-cados en las áreas de Hospitalización, Unidad de Terapia Infan-til y Unidad de Terapia de Adultos. Los perfiles de resistencia entre las 5 cepas, varían por la presencia de resistencias a Trimetoprima/ Sulfametoxazol en las cepas 51 y 52, y la falta de resistencia a Ampicilina/Sulbactam de la cepa 59 (Tabla 1).
En el Hospital “Dr. José María Vargas” se encontraron cepas de Klebsiella pneumoniae, cepas 101 y 112 que presentaron una estrecha relación clonal. El fenotipo de resistencia entre ambas es idéntico, indicativo de su relación clonal (Tabla 1).
En el Hospital “Dr. Domingo Luciani” se encontraron 3 cepas de E.coli 182, 196 y 198 clasificadas por ERIC-PCR como relacionados clonalmente y por REP-PCR como aislados con una posible relación clonal. Los perfiles de resistencia entre las tres cepas varían por la resistencia a cefalotina, aztreonam, cloramfenicol,cepa 182 y ciprofloxacina, 196 y 198. Estas ce-pas fueron aisladas de la Unidad de Cuidados Intermedios (U.C.I.) y de Hospitalización. Así mismo se encontraron 2 ce-pas de E. coli, cepas 159 y 162 clasificadas por ERIC-PCR como de una estrecha relación clonal y por REP-PCR como con una posible relación clonal. Estas 2 cepas fueron aisladas de la U.C.I. y presentaron un perfil de resistencia similar, a excepción de las resistencias a cloramfenicol, trimetropina/ sulfametoxazol y ciprofloxacina (Tabla 1).
Discusión
Cuando varios aislados son clasificados como genéticamente indistinguibles, mediante un método de tipificación molecular, se puede asumir que estos derivaron recientemente de un ancestro común, a través de una cadena de eventos relacionados.
Según nuestros resultados, la tipificación molecular reveló una considerable variabilidad genética entre las cepas de la mis-ma especie. No se detectó diseminación de clones bacterianos entre los hospitales que conformaron nuestro estudio.
En el Centro Médico de Caracas y en la Policlínica Metropo-litana se encontraron clones en diferentes servicios, sugirien-do la diseminación de clones bacterianos dentro de los cen-tros de salud.
Nuestros resultados nos permiten inferir como se están dise-minando los determinantes de resistencia. La mayoría de las cepas analizadas presenta variabilidad en sus perfiles de re-sistencia y en su mayoría presentan variabilidad genética cromosomal. Ambos resultados sugieren, que en los cuatros centros hospitalarios, la diseminación de los determinantes de resistencia principalmente no es por la propagación de clones bacterianos sino por vía horizontal.
Así mismo, las cepas relacionadas clonalmente presentan di-ferencias en los fenotipos de resistencia, sugiriendo una ad-quisición de los determinantes de resistencia por vía horizon-tal, posiblemente vía plásmidos conjugativos portadores de genes de resistencia. Las cepas clonalmente relacionadas en-contradas en el Centro Médico de Caracas, que poseen perfi-les de resistencia diferentes, representan una prueba que apo-ya nuestra proposición.
- La tipificación molecular reveló una considerable variabi-lidad genética entre las cepas de E. coli y K. pneumoniae
- En el Centro Médico de Caracas y en la Policlínica Metro-politana se encontraron clones diseminados en diferentes servicios de los centros de salud.
- En los cuatros centros hospitalarios, la diseminación de los determinantes de resistencia no pareciera ser por la propaga-ción de clones bacterianos sino por transferencia horizontal.
Agradecimientos
A los Licenciados, Alberto Calvo y Nicolás Rodríguez (Policlínica Metropolitana), Adela Rizzi (Centro Médico de Caracas), José Luís Rodríguez (Hospital “Dr. José María Vargas”), Ninoska Montilla (Hospital “Dr. Domingo Luciani”); y al Dr. Manuel Guzmán, por el apoyo brindado para la reali-zación de este estudio. Este trabajo fue financiado por el Con-sejo de Desarrollo Científico y Humanístico (CDCH) a GA (03-33-5417-2004 y 03-33-5416-2004)
Referencias
- Pfaller MA. Molecular approaches to diagnosing and manag-ing infections diseases practicality and costs. Emerging Infec-tions Diseases. 2001;7: 312-318
- osin I, Silbert S, Sader H. The use of molecular typing to evaluate the dissemination of antimicrobial resistance among Gram-negative in Brazilian hospitals. The Brazilian Journal of Infectious Diseases, 2003;7:360-369.
- Fernández-Cuenca F. Aplicaciones de las técnicas de PCR a la epidemiología Molecular de las enfermedades infecciosas. Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica. 2004;22:355-360.
- Versalovic J, Koeuth T, Lupski J. Distribution of repetitive DNA sequence in eubacterias and application to fingerprinting of bacterial genomes. Nucleic Acids Research, 1991;19:6823-6831.
- Lévesque C, Piché L, Larose C, Roy PH. PCR mapping of integrons reveals several novel combinations of resistance genes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1995;39:185-188
- Rademarker JLW, Louws FJ, De Brujin FJ. Characterization of diversity of ecologically important microbes by REP-PCR ge-nomic fingerprinting. In Molecular Microbial Ecology Manual. Pp. 1-26. Kluwer Academic publishers dordrecht.1997.
- Horcajada J, Vila J, Moreno-Martinez J., et al. Molecular Epi-demiology and evolution to resistance to quinolones in Escheri-chia coli alter prolonged administration of ciprofloxacin in patients whit prostatitis, Journal of Microbial Chemotherapy 2002;49:(55-59)
- Tenover FC, Arbeit RD, Goering RV, Mickelsen PA, Murray BE., Persing DH, Swaminathan B. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electro-phoresis: criteria for bacterial strain syping. Journal of Clinical Microbiology, 1995;33:2233–2239.
